Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe, um Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung in vitro zu erreichen. Die Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau reduziert die experimentelle Variation und erhöht die Reproduzierbarkeit.

Zusammenfassung

Die in vitro Untersuchung der Differenzierung von weißen, braunen und beigen Adipozyten ermöglicht die Untersuchung zellautonomer Funktionen von Adipozyten und ihrer Mechanismen. Immortalisierte weiße Präadipozyten-Zelllinien sind öffentlich zugänglich und weit verbreitet. Die Entstehung von beigen Adipozyten im weißen Fettgewebe als Reaktion auf äußere Signale lässt sich jedoch nur schwer in vollem Umfang mit öffentlich zugänglichen weißen Adipozytenzelllinien rekapitulieren. Die Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe wird üblicherweise durchgeführt, um primäre Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung durchzuführen. Das Zerkleinern und die Kollagenase-Verdauung von Fettgewebe von Hand kann jedoch zu experimentellen Variationen führen und ist anfällig für Verunreinigungen. Hier stellen wir ein modifiziertes halbautomatisches Protokoll vor, das einen Gewebedissoziator für den Kollagenaseverdau verwendet, um eine einfachere Isolierung des SVF zu erreichen, mit dem Ziel, die experimentelle Variation zu reduzieren, die Kontamination zu reduzieren und die Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Die gewonnenen Präadipozyten und differenzierten Adipozyten können für funktionelle und mechanistische Analysen verwendet werden.

Einleitung

Die Biologie des Fettgewebes hat aufgrund der weltweit zunehmenden Prävalenz von Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes immer mehr Aufmerksamkeit auf sich gezogen¹. Adipozyten speichern überschüssige Energie in Form von Lipidtröpfchen, die beim Verhungern freigesetzt werden. Darüber hinaus hält das Fettgewebe die systemische Energiehomöostase aufrecht, indem es als endokrines Organ dient und mit anderen Geweben kommuniziert ^2,3. Interessanterweise werden sowohl überschüssiges Fettgewebe (Fettleibigkeit) als auch Fettabbau (Lipodystrophie) mit Insulinresistenz und Diabetes in Verbindung gebra....

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Tokio genehmigt und nach den institutionellen Richtlinien der Universität Tokio durchgeführt.

1. Herstellung von Enzymlösung und Medium

1. Geben Sie beide Seiten des weißen Leistenfettgewebes (rechte und linke Seite, ca. 150 mg) einer 7-8 Wochen alten Maus und 2,5 ml Enzymlösung in das Röhrchen C des Dissoziators.
2. Rekonstituieren Sie Enzym D mit 3 ml Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM)/F12 ohne fötales Kälberserum (FBS) oder Antibiotika, Enzym R mit 2,7 ml DMEM/F12 ohne F....

Diskussion

In dieser Arbeit haben wir ein Protokoll zur Isolierung des SVF aus murinem Fettgewebe beschrieben, um Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung in vitro durchzuführen. Die Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau verringerte die experimentelle Variation, verringerte das Risiko einer Kontamination und erhöhte die Reproduzierbarkeit. Obwohl dieses Verfahren ein kritischer Schritt innerhalb des vorgestellten Protokolls ist, ist der Prozess hochgradig automatisiert und es.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm dish	Corning	430167
12 well plate	Corning	3513
60 mm dish	IWAKI	3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat	Miltenyi Biotec	130-105-808	contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm	BD falcon	#352350
Collagen coated dishes, 100 mm	BD	#356450
Collagen coated dishes, 60 mm	BD	#354401
Collagen I Coat Microplate 6 well	IWAKI	4810-010
Dexamethasone	Wako	041-18861
Dissecting Forceps	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp	N/A	N/A	autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	N/A	N/A
gentleMACS C Tubes	Milteny Biotec	130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Humulin R Injection U-100	Eli Lilly	872492
Indomethacin	Sigma	I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX)	Sigma	17018-1G
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019
Neomycin Sulfate	Fujifilm	146-08871
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40)	Add gene	#1780
PBS tablets	Takara	T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	cell biolab	RV-101
Polybrene	Nacalai Tesque	12996-81
Power Sybr Green Master Mix	Applied Biosystems	4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	TOYOBO	#FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
Rosiglitazone	Wako	180-02653
T3	Sigma	T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25200-056