Effektive schnelle Blutdurchblutung bei Xenopus

Zusammenfassung

Hier wird ein effektives Protokoll zur schnellen Blutperfusion vorgestellt, um Gewebeproben von afrikanischen Krallenfröschen für Transkriptomik- und Proteomik-Studien vorzubereiten.

Zusammenfassung

Xenopus sind seit über 100 Jahren leistungsfähige Modellorganismen für das Verständnis der Entwicklung und Krankheit von Wirbeltieren. Hier wird ein schnelles Blutdurchblutungsprotokoll bei Xenopus definiert, das auf eine konsistente und drastische Reduzierung des Blutes in allen Geweben abzielt. Die Perfusion erfolgt durch das Einführen einer Nadel direkt in die Herzkammer und das Pumpen von heparinisierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch das Gefäßsystem. Die Prozedur kann in ca. 10 Minuten pro Tier durchgeführt werden. Das Blut wird von einigen wenigen Proteinen und Zelltypen dominiert, die sehr häufig vorkommen, was zu zahlreichen Problemen führt, da diese Proteine die meisten anderen Moleküle und Zelltypen von Interesse maskieren. Die reproduzierbare Charakterisierung von adulten Xenopus-Geweben mit quantitativer Proteomik und Einzelzell-Transkriptomik wird von der Anwendung dieses Protokolls vor der Organentnahme profitieren. Die Protokolle für die Gewebeentnahme sind in Begleitpapieren definiert. Diese Verfahren zielen auf die Standardisierung von Praktiken bei Xenopus unterschiedlichen Geschlechts, Alters und Gesundheitszustands ab, insbesondere bei X. laevis und X. tropicalis.

Einleitung

Die Ganzkörperperfusion von Amphibien wird routinemäßig zum Zwecke der Konservierung und Fixierung durchgeführt 1,2,3,4,5,6. Diese Verfahren erfolgen jedoch in einem Tempo, das die Anzahl der frischen Proben, die pro Tier entnommen werden können, begrenzt. Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein effektives Blutperfusionsprotokoll in Xenopus zu entwickeln, wobei die Geschwindigkeit der Technik im Vordergrund steht. Das Protokoll dauert weniger als 10 Minuten pro Tier für X. tropicalis und weniger als 15 Minuten pro X. laevis-Tier. Die sekundären Prioritäten sind die einfache Replikation und die Verwendung von leicht zu beschaffenden Geräten, so dass qualitativ hochwertige Proben zwischen den Xenopus-Laboren ausgetauscht werden können.

Xenopus-Frösche werden in der biomedizinischen Forschung häufig eingesetzt, um grundlegende biologische und pathologische Prozesse zu untersuchen, die über Arten hinweg konserviert sind. Dieser Tetrapode hat eine engere evolutionäre Beziehung zu Säugetieren als andere aquatische Modelle, da er Lungen, ein Dreikammerherz und Gliedmaßen mit Fingern hat. Die internationale Gemeinschaft nutzt Xenopus effektiv, um durch eingehende Krankheitsmodellierung und molekulare Analyse der krankheitsbedingten Genfunktion ein tieferes Verständnis menschlicher Krankheiten zu erlangen. Die zahlreichen Vorteile von Xenopus als Tiermodell machen sie zu unschätzbaren Werkzeugen, um die molekularen Grundlagen der menschlichen Entwicklung und Krankheit zu untersuchen. Zu diesen Vorteilen gehören: große Eizell- und Embryogröße, hohe Fruchtbarkeit, einfache Unterbringung, schnelle äußere Entwicklung und einfache genomische Manipulation. Es wird geschätzt, dass Xenopus ~80% der identifizierten menschlichen Krankheitsgene teilen⁷.

Im Vergleich zu populären Säugetiermodellen ist Xenopus ein schnelles, kostengünstiges Modell, das sich leicht mit dem Morpholino-Knockdown und der Verfügbarkeit effizienter Transgene und gezielter Genmutationen unter Verwendung von CRISPR⁸ auszeichnet. Quantitative Massenspektrometrie und Einzelzell-Transkriptomik wurden erfolgreich auf Xenopus-Embryonen angewendet^9,10, aber ein aktueller Zellatlas von Xenopus laevis zeigt, dass die Zusammensetzung der meisten Gewebe von Blutzelltypen dominiert wird ¹¹. Durch die Entwicklung einer Technik, die Gewebe schnell ausblutet, und unter Verwendung von gekühlten Medien wird die Probenfrische durch die Perfusion nur minimal beeinträchtigt. Dies ist besonders wichtig für Anwendungen, bei denen es darum geht, eine physiologisch ungestörte mRNA- oder Proteinexpression zu profilieren.

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Protokoll

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3) durchgeführt.

ANMERKUNG: Obwohl die beschriebene primäre Methode der Euthanasie von der American Veterinary Medical Association¹² als akzeptable Technik für die Euthanasie angesehen wird, wurde nicht festgestellt, dass sie zum Stillstand eines Herzschlags führt¹³. Auch die häufig angewandte sekundäre Methode des doppelten Sagenmachens verhindert dies nicht, ebenso wenig wie die Entnahme des Herzens aus dem Tier. Die Ausblutung von betäubten Tieren gilt als humane und effektive Methode für eine erfolgreiche Euthanasie¹². Da die Erhaltung von frischem Gewebe durch Euthanasie das Ziel dieses Protokolls ist, ist es von Vorteil, dass das Herz während der primären Euthanasie mit MS-222 weiter schlägt und dass die Perfusion selbst eine sekundäre Euthanasiemethode durch Ausblutung ist.

1. Vorbereitung

1. Stellen Sie sicher, dass die Forschungseinrichtung die in diesem Protokoll beschriebene Euthanasie- und Perfusionstechnik genehmigt hat.
2. Bereiten Sie eine Lösung aus 5 g/l MS-222 (Tricainmethansulfonat) und 5 g/l Natriumbicarbonat vor. Das Volumen sollte größer sein als das Volumen, das erforderlich ist, um die einzuschläfernden Tiere vollständig zu bedecken. Überprüfen Sie den pH-Wert, um sicherzustellen, dass er ≥7 beträgt.
3. Bereiten Sie 500 μl 180 U/ml Heparin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pro X. laevis oder 200 μl pro X. tropicalis vor.
4. Führen Sie eine primäre Euthanasie durch, indem Sie den Xenopus in diese Lösung geben (aus Schritt 1.2). Das Tier bleibt insgesamt 1 Stunde unter Wasser.
5. Bestätigen Sie, dass der Xenopus seine Schmerzreaktion verloren hat, indem Sie den Fuß 15 Minuten nach der Euthanasie einklemmen. Wenn das Tier reaktiv ist, geben Sie es der Euthanasielösung zurück, bis diese Reaktion verloren geht.
6. Wiegen Sie den Xenopus und nehmen Sie alle zusätzlichen Messungen vor, die vor der Probenahme erforderlich sind.
7. Injizieren Sie X. laevis mit einer 31-G-Nadel mit 250 μl und X. tropicalis mit 100 μl 180 U/ml Heparin in PBS (aus Schritt 1.3) in die Muskulatur jeder Vordergliedmaße.
8. Bereiten Sie eine Lösung von 1 ml/g des Tiergewichts von 54 U/ml Heparin in PBS-Perfusat vor. Personen, die mehr Erfahrung mit diesem Protokoll haben, können feststellen, dass weniger Medien erforderlich sind, um die Perfusion abzuschließen.
9. Verwenden Sie eine 22 g Injektionsnadel für die Perfusion von X. laevis und eine 25 g Injektionsnadel für X. tropicali s. Stumpfen Sie die Perfusionsnadel, indem Sie die Spitze mit einem Drahtschneider abschneiden (Abbildung 1)¹⁴.
   Anmerkungen: Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, dass die Nadel durch die Herzkammer perforiert, wenn sie verschoben wird. Zusätzlich zur Abstumpfung kann die Nadel mit einem Schleifstein oder einer Feile leicht abgeschliffen werden, bleibt aber immer noch scharf genug, um die Herzkammer zu durchbohren.
10. Bereiten Sie die Pumpe vor, indem Sie die gekürzte Nadel anbringen und 54 U/ml heparinisiertes PBS-Perfusat zirkulieren lassen (aus Schritt 1.8). Stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen aus dem Schlauch entfernt werden, um die Möglichkeit einer Luftembolie auszuschließen, die zu einer verminderten Perfusionseffizienz oder einem Versagen führt (siehe Tabelle 1). Bewahren Sie das Perfusionsmedium für die Dauer des Eingriffs auf Eis auf.
11. Wenn die Pumpe nicht programmierbar ist, messen Sie bei eingesetzter Nadel das Fördervolumen des Mediums unter den verschiedenen Einstellungen, um zu bestimmen, welche Einstellungen 5 ml/min und 10 ml/min am nächsten kommen. Diese Durchflussraten werden unabhängig von der Art verwendet. Wenn die Perfusionspumpe programmierbar ist, kalibrieren Sie sie mit eingesetzter Nadel gemäß den Anweisungen des Herstellers.
12. Platzieren Sie die Dissektionsfläche (Schale oder Schaumstoffplatte) schräg in einem sekundären Behälter oder ordnen Sie sie so an, dass sie den Blutabfluss erleichtert.
13. Sobald der Frosch 1 h in der Lösung war, ist die primäre Euthanasie abgeschlossen. Entfernen Sie den Frosch und überprüfen Sie den Verlust der Schmerzreaktion erneut, indem Sie einen Fuß kneifen lassen.
14. Legen Sie den Frosch auf den Rücken und stecken Sie jedes Glied fest (Abbildung 2). Wenn das Gewebe der Gliedmaßen erhalten werden muss, können dünne Stifte durch die Finger oder U-förmige Klammern um die Gliedmaßen gelegt werden.
15. Schneiden Sie mit einer Sezierschere durch die Haut, die Mittellinie hinauf und dann seitlich, so dass zwei Klappen entstehen. (Abbildung 2)
16. Fassen Sie die Linea alba mit einer Pinzette und ziehen Sie sie von der Zölomhöhle weg (Abbildung 3). Schneiden Sie vorsichtig mit einer Schere durch die Muskulatur. Machen Sie zwei Klappen aus der Hohlraumwand und schneiden oder stecken Sie alle Klappen aus dem Weg.
17. Verwenden Sie eine Dissektionsschere, um die Coracoideusknochen zu durchtrennen und überschüssiges Gewebe wegzuschneiden, um einen besseren Zugang zum Herzen zu erhalten (Abbildung 3).
18. Das Herz sollte noch schlagen. Wenn das Herz vor der Perfusion aufgehört hat zu schlagen, beachten Sie, dass die Frische der Probe beeinträchtigt wurde.

2. Perfusion

1. Identifizieren Sie den Magen und verschieben Sie ihn sanft so, dass er sich auf dem linken Leberlappen (auf der rechten Seite des Betrachters) befindet und sein Gefäßsystem für die Dauer des Eingriffs sichtbar ist. Identifizieren Sie eine Lunge und fassen Sie sie mit einer Gewebezange an der Spitze. Ziehen Sie die Lunge aus der Zölomhöhle heraus und stecken Sie sie durch die Spitze (Abbildung 4). Tun Sie dies vorsichtig, da geplatzte Blutgefäße nicht gut durchbluten. Achten Sie darauf, ob Blut im Lappen sichtbar ist, da dies die Fähigkeit beeinträchtigt, den Abschluss des Verfahrens zu bestimmen.
2. Machen Sie ein Bild der Zölomhöhle, um die Perfusionseffizienz besser beurteilen und möglicherweise abnormales Gewebe zu einem späteren Zeitpunkt zu identifizieren.
3. Identifizieren Sie das dünne Perikard und ziehen Sie es mit einer Gewebezange (Abbildung 5). Perforieren Sie den Herzbeutel vorsichtig mit der Spitze der Iridektomieschere und achten Sie darauf, das darunter liegende Gewebe nicht zu schneiden. Schäle den Herzbeutel von den drei Herzkammern weg.
4. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Ventrikel sanft an seiner Spitze zu fassen. Üben Sie einen begrenzten Druck aus, damit zwischen den Zugflächen der Pinzette genügend Platz für den Durchgang der Perfusionsnadel vorhanden ist (Abbildung 6).
5. Führen Sie die Nadel durch den Verschluss der Pinzette in die Kammer der Herzkammer ein und achten Sie darauf, dass sie nicht durch die Herzkammer perforiert wird (Abbildung 7). Klemmen Sie die Gewebepinzette mit einem Nadelhalter mit einem Hämostaten fest.
   HINWEIS: Diese Technik stabilisiert die Position der Nadel, die immer noch scharf ist. Das Einklemmen der Nadel direkt in die Herzkammer führt ebenfalls zu unnötigen Schäden, was das Umspannen erschwert, falls dies erforderlich ist (siehe Tabelle 1).
6. Starten Sie den Durchfluss der Pumpe bei ca. 5 ml/min. Die drei Kammern des Herzens und des Truncus arterielle werden anschwellen (Abbildung 8; siehe Tabelle 1).
7. Lanzen Sie mit einer Schere vorsichtig die rechte Ohrmuschel (links vom Betrachter); Blut wird herausfließen. Stellen Sie die Flussrate auf 5 ml/min ein oder erhöhen Sie sie auf 10 ml/min.
8. Fahren Sie fort, bis die Magengefäße blass sind (siehe Tabelle 1), dann lanzen Sie die linke Ohrmuschel des Herzens (rechts vom Betrachter). Wenn die Flussrate immer noch 5 ml/min beträgt, erhöhen Sie sie auf ca. 10 ml/min.
9. Verwenden Sie eine Transferpipette, um die Zölomhöhle in Perfusionsmedien zu spülen, um die Sichtbarkeit zu erhalten und die Farbe des Perfusats, das aus den Ohrmuscheln fließt, besser beurteilen zu können.
10. Lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle, bis das aus den Ohrmuscheln fließende Perfusat klar ist (siehe Tabelle 1) und die Lunge ihren roten Farbton verloren hat (siehe Tabelle 1; Abbildung 9).

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Ergebnisse

Nach erfolgreicher Durchblutung sind alle Gewebe (mit Ausnahme der Leber bei pigmentiertem Xenopus) deutlich heller und weniger durchblutet. Die großen Blutgefäße werden weniger auffällig (Abbildung 10), und das Gewebe (mit Ausnahme der Leber) wird nach der Entnahme sauber im Puffer gespült. Während die erfolgreiche Durchführung des Protokolls letztlich nur durch die Qualität der Daten aus exbluteten Gewebeproben bestätigt werden kann, werden in der Tabelle zur Fehlerbehebu...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt traditionelle Dissektionstechniken für den Zugang zur Zölomhöhle. Andere Techniken sind ebenfalls akzeptabel, vorausgesetzt, sie verursachen nur minimale Schäden am Gewebe, das Herz ist zugänglich und die Lunge und der Magen sind sichtbar. Ebenso können die meisten aufgeführten Sezierwerkzeuge leicht durch vergleichbare Gegenstände ersetzt werden.

Obwohl versucht wurde, die Wirksamkeit dieses Verfahrens zu optimieren, können die Ergebnisse je nach Erfahrung...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP