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  • Zusammenfassung
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  • Einleitung
  • Protokoll
  • Repräsentative Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
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  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ein Dreikanal-Dual-Reporter-Fluoreszenz-Flussanalysesystem wurde verwendet, um einen Bead-basierten Multiplex-Immunoassay zu entwickeln, der gleichzeitig Serumproben auf IgG und IgM auswertet, die gegen mehrere Antigene verschiedener Borrelienspezies extrahiert wurden, die die Lyme-Borreliose in Europa und Nordamerika verursachen.

Zusammenfassung

Um das Fortschreiten von Infektionskrankheiten zu überwachen, ist es nützlich, die Immunreaktivität gegen verschiedene antigene Determinanten zu bewerten und verschiedene Antikörper-Isotypen zu messen, da sie in verschiedenen Stadien der Immunantwort des Wirts auftreten. Bei der Lyme-Borreliose kann der Erreger eines der zahlreichen Mitglieder der Borrelien-Spezies sein. Daher erfordert eine korrekte Probenklassifizierung die Bewertung der Immunreaktivität gegen verschiedene Antigene verschiedener Borrelienarten . Darüber hinaus können antipathogene IgG- und IgM-Antworten während des Fortschreitens der Erkrankung unterschiedliche Auslösezeitverläufe haben. In dieser Arbeit demonstrieren wir die Entwicklung eines Zwei-Reporter-Multiplex-Immunoassays, der bei der Identifizierung der Borrelien-spezifischen Immunantwort in humanen Serumproben nützlich ist, indem gleichzeitig sowohl die IgG- als auch die IgM-Immunreaktivität gegen verschiedene bakterielle Antigene in derselben Reaktionswelle bewertet werden. Dieser Dual-Reporter-Ansatz behält die analytische Leistung von Single-Reporter-Methoden bei und spart gleichzeitig Zeit und Ressourcen und reduziert die Anforderungen an die Stichprobengröße. Dieser Assay ermöglicht es, im Wesentlichen die doppelte serologische Information aus einer Blutprobe in der Hälfte der Zeit zu generieren.

Einleitung

Die Lyme-Borreliose ist die häufigste durch Zecken übertragene Infektionskrankheit in gemäßigten Klimazonen der nördlichen Hemisphäre1. Sie wird durch Spirochätenbakterien der Gattung Borrelien verursacht, von denen fünf humanpathogene Krankheitserreger bekannt sind, die sich in ihrer geografischen Verbreitung unterscheiden2. Die wichtigsten pathogenen Borrelienarten in Europa sind B. afzelii und B. garinii, wobei B. burgdorferi s.s., B. spielmanii und B. bavariensis seltener betroffen sind. In Nordamerika ist B. burgdorferi s.s. der alleinige Erreger der Lyme-Borreliose 2,3. Borrelien-Erreger werden von Mitgliedern der Zeckengattung Ixodes übertragen, wobei die Übertragung innerhalb von 24 Stunden nach dem Zeckenstich erfolgen kann4.

Die Diagnose der Lyme-Borreliose wird in der Regel durch klinische Symptome gestellt und anschließend durch Serologie bestätigt. Sowohl in Europa als auch in Nordamerika empfehlen die diagnostischen Leitlinien eine zweistufige Testreihe, die aus einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) mit einem Reflex-Immunoblot besteht, um die Antikörperantwort gegen Borrelien-spezifische Antigene zu bewerten 1,5,6,7,8,9 . Dieser Ansatz ist jedoch nicht sensitiv und suboptimal, insbesondere in der frühen Phase der Infektion, wenn die Serokonversion unvollständig sein kann und die Anti-Borrelien-IgG- und IgM-Titer zu niedrig sind6.

Multiplex-Immunoassays verbessern herkömmliche Immunoassays, die jeweils nur ein Ziel messen und gleichzeitig mehrere Antikörper-Isotypantworten gegen ein oder mehrere Antigene bewerten können 10,11,12. Assays wie ELISAs beschränken sich auf die Identifizierung und Quantifizierung eines einzelnen Analyten pro Reaktion, im aktuellen Fall entweder zirkulierendes IgG oder IgM, das nach einer Infektion mit Borrelien gegen ein einzelnes bakterielles Antigen induziert wird. Dieser Bericht veranschaulicht die Verwendung der Bead-basierten Analyt-Profiling-Technologie für die Entwicklung eines Multiplex-Immunoassays, der gleichzeitig sowohl IgG- als auch IgM-Antikörper gegen eines der hier ausgewählten Borrelien-Antigene in menschlichen Serumproben nachweist. Wir haben vier Antigene ausgewählt, die zusammen die häufigsten pathogenen Borrelienarten abdecken, die in Europa heimisch sind (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) und Nordamerika (B. burgdorferi s.s.) (Tabelle 1) 2,3. Dies ermöglicht eine entscheidende Identifizierung von Krankheitserregern und die Fähigkeit, eine frühe IgM- und später eine dauerhaftere IgG-Immunreaktivität in Patientenproben zu erkennen.

Ziel-IsotypReporter-KanalAntigenBorrelien-ArtenDehnungKonzentration der Antigenkopplung
IgmPEOspCB. garinii200475,0 μg/106 Perlen
IgGBV421-KARTONVlsEB. burgdorferi s.sNr. B311,25 μg/106 Kügelchen
IgGBV421-KARTONDbpAB. burgdorferi s.s.ZS7-KARTON10,0 μg/106 Perlen
IgGBV421-KARTONDbpAB. afzeliiPKo5,0 μg/106 Perlen

Tabelle 1: Repräsentative Borrelien-Antigene , die für die Entwicklung von Multiplex-Assays verwendet werden.

Wir entwickelten zunächst einen Single-Reporter-Immunoassay, der entweder Anti-Borrelien-Antigen-IgG- oder IgM-Antikörper in zwei separaten Reaktionen detektierte, und führten diese Assays dann zu einem Dual-Reporter-Multiplex-Assay zusammen, der beide Antikörper-Isotypen in derselben Reaktionsmischung misst. Magnetische Kügelchen werden an ein Zielantigen des Krankheitserregers gekoppelt und dann mit Serumproben des Patienten inkubiert. Das Bead-gekoppelte Antigen wird sowohl von zirkulierendem IgG als auch von IgM im Serum erkannt und eingefangen, das in einer Immunantwort gegen dieses pathogene Antigen erzeugt wird. Die Spezifität von Assay-IgG im Vergleich zu IgM wird durch die Auswahl eines sekundären Antikörpers bestimmt, der entweder an IgG oder IgM bindet, wobei jeder ein eindeutiges Fluorophorsignal aufweist, das mit den beiden sekundären Antikörpern assoziiert ist. Jedes Fluoreszenzsignal wird in einem der beiden Reporterkanäle des Instruments (d. h. Dual-Reporter) detektiert, der über einen anderen Anregungslaser und eine andere Emissionserfassung verfügt, die spezifisch für den einzelnen Fluorophor ist, der zum Nachweis von IgG oder IgM verwendet wird (hier Brilliant Violet 421 bzw. Phycoerythrin). Der Klassifikationskanal des Instruments identifiziert den farbcodierten Farbstoff, der in verschiedenen Perlensätzen enthalten ist. Auf diese Weise können mehrere Zielantigene an unterschiedlich gefärbte Kügelchen gekoppelt und die Kügelchensätze miteinander vermischt und verwendet werden, um die Immunreaktivität verschiedener Krankheitserreger in Serumproben umfassend zu bewerten. Der Klassifikationskanal identifiziert jeden einzelnen Bead-Satz (d. h. spezifisches Antigen) und misst die Fluoreszenz, die mit IgG oder IgM gegen dieses Antigen assoziiert ist. Der daraus resultierende Multiplex-Assay spart Zeit und Ressourcen im Vergleich zu weniger umfassenden klassischen Tests und katalogisiert die Lyme-Borreliose in begrenzten Probenvolumina genau. Während ein ähnlicher Dual-Reporter-Ansatz bereits zur Kategorisierung von Immunantworten bei anderen Pathologien wie der SARS-CoV-2-Infektion verwendet wurde13, beschreibt dieser Bericht die Anwendung der Multiplex-Fluoreszenz-Assay-Technologie zur Charakterisierung der Immunreaktivität bei Lyme-Borreliose.

Protokoll

Für die Verwendung von humanen Serumproben in dieser Versuchsreihe wurde die entsprechende Genehmigung des Institutional Review Board bzw. der Ethikkommission erteilt. Bei den Proben handelte es sich um anonymisierte Reststoffe aus einer deutschen nationalen Studie zur SARS-CoV-2-Seroprävalenz14. Die Genehmigung für die Verwendung humaner Proben wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover erteilt (9086_BO_S_2020). In der aktuellen Studie wurden insgesamt 21 humane Serumproben verwendet.

1. Ethische Genehmigung für die Verwendung menschlicher Proben

  1. Einholung geeigneter ethischer Genehmigungen für die Verwendung von menschlichen Proben.

2. Reagenzien und Ausrüstung

  1. Humane Serumproben: Durchführung einer technischen Assay-Validierung und Qualitätskontrolle anhand von Serumproben von Personen, bei denen zuvor Lyme-Borreliose diagnostiziert wurde, oder von Personen, bei denen ein Borrelien-negativer Immunstatus nachgewiesen wurde12,14.
  2. Instrumentierung mit einem Reporter. Verwenden Sie ein Zweikanal-Einzelreportergerät (Materialtabelle) für die anfängliche Assay-Entwicklung und technische Validierung.
    HINWEIS: Das Single-Reporter-System verfügt über zwei Laser: 1) identifiziert und quantifiziert die Bead-Set-spezifische Fluoreszenz, um verschiedene Bead-Sets zu unterscheiden, falls verwendet (Klassifizierungskanal), und 2) detektiert und quantifiziert die Bead-gebundene zielspezifische Phycoerythrin (PE)-Fluoreszenz (Reporterkanal; 532 nm Anregung, "orange" 565-585 nm Emission). Daher kann nur eine einzige Antikörper-Isotypklasse (z. B. entweder IgG oder IgM) gleichzeitig mit dem einzelnen Reporterkanal analysiert werden.
    1. Durchführung erster Validierungsstudien zur separaten Bewertung von Anti-Borrelien-IgG und IgM in einem 96-Well-Format mit einem einzigen Reporter, bei dem PE-markierte Nachweisreagenzien für beide Antikörperklassen verwendet werden.
      HINWEIS: Der aktuelle Assay bewertet zirkulierende IgGs, die spezifisch für das Borrelien-Antigen VlsE und zwei Varianten von DbpA sind, sowie zirkulierendes IgM, das spezifisch für das Antigen OspC ist, als repräsentative Beispiele. Der Assay kann erweitert werden, um die Immunreaktivität des Serums gegen andere Anti-Borrelien-Antigene zu bewerten, wie gewünscht12.
  3. Dual-Reporter-Instrumentierung. Verwenden Sie ein Dreikanal-Dual-Reporter-Gerät (Materialtabelle), das eine gleichzeitige IgG/IgM-Analyse in derselben Reaktion ermöglicht, für die Entwicklung und technische Validierung des dualen IgM/IgG-Assays (siehe unten). Dieses Gerät verfügt über insgesamt 3 Fluoreszenz-Detektionskanäle, von denen 2 Reporterkanäle sind, die gezielte Ig-assoziierte Signale auswerten.
    HINWEIS: Das Dual-Reporter-System verfügt über drei Laser: 1) identifiziert und quantifiziert die Bead-Set-spezifische Fluoreszenz (Klassifikationskanal); 2) detektiert und quantifiziert die zielspezifische Phycoerythrin (PE)-Fluoreszenz (Reporterkanal 1; 532 nm Anregung, "orange" 565-585 nm Emission) und 3) bewertet die zielspezifische Brillantviolett 421 (BV421) Fluoreszenz eines zweiten Zielanalyten (Reporterkanal 2; 405 nm Anregung, "blaue" 421-441 nm Emission). Das Dual-Reporter-System ist sowohl mit 96-Well- als auch mit 384-Well-Mikrotiterplatten-Assay-Formaten (halbautomatische Handhabung) kompatibel. Das allgemeine Analyseschema ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Protokollschritte werden im Folgenden beschrieben.

3. Antigen-Kopplung

  1. Koppeln Sie die Borrelien-Antigene an magnetische, carboxylierte und fluoreszierende farbkodierte 6,5-μm-Mikrosphären (Kügelchen; Material-Tabelle) unter Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/Sulfo-N-hydroxysuccinimid (sNHS)-Chemie.
    HINWEIS: Eine detaillierte Beschreibung finden Sie in Referenz11undReferenz 12. Die Kopplungskonzentration der einzelnen Antigene finden Sie in Tabelle 1. Gekoppelte Perlen sollten bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 °C gelagert werden. Alle Puffer, die bei Kopplungs- und Detektionsreaktionen verwendet werden, sind in den ergänzenden Materialien beschrieben.

4. Testverfahren: Serologischer Einzelreporter-IgG- oder IgM-Test: 96-Well-Format

  1. Verdünnen Sie die Probe in 2 Schritten (2 Schritte, beide in 96-Well-Platten; 200-fache Verdünnung der Serumprobe im Assay-Puffer).
    HINWEIS: Die Zusammensetzung des Assay-Puffers ist eine 1:4-Mischung aus Low Cross Buffer: PBS mit 1 % (w/v) Rinderserumalbumin. Tween-20 wird dem Gemisch bis zu einer Endkonzentration von 0,05 % (v/v) zugegeben.
    1. Probenverdünnung Schritt 1: Mischen Sie 5 μl der Serumprobe mit 120 μl des Assay-Puffers (25-fache Verdünnung).
    2. Probenverdünnung Schritt 2: Verdünnen Sie die 25-fache Probenverdünnung zusätzlich 8-fach, indem Sie 10 μl der Verdünnung mit 70 μl des Assay-Puffers mischen, um die endgültige Probenverdünnung um das 200-fache zu erreichen.
  2. Verdünnung der magnetischen Perlenmischung
    1. Bereiten Sie eine Kügelchenmischung mit 1,0 × 106 Kügelchen/ml pro Kügelchenpopulation (d. h. pro eindeutigem Zielantigen) vor.
    2. Die vorbereitete Kügelchenmischung wird 25-fach im Assay-Puffer verdünnt, damit die endgültige Kügelchenkonzentration in dieser verdünnten Suspension nun 4 × 104 Kügelchen/ml pro Kügelchenpopulation (d. h. pro eindeutigem Zielantigen) beträgt.
  3. Inkubation von Serumproben mit Beads
    1. Pipettieren Sie 25 μl verdünnte gekoppelte Multiplex-Bead-Suspension (enthält 4,0 × 104 Beads/Set/ml) in die zugewiesenen Vertiefungen einer 96-Well-Halbflächen-Mikrotiterplatte (Materialtabelle).
    2. 25 μl einer 200-fach verdünnten Serumprobe (aus Schritt 4.1 oben) werden in geeignete Vertiefungen mit 25 μl gekoppelter Bead-Suspension gegeben.
      HINWEIS: Dies führt zu einer zusätzlichen 2-fachen Verdünnung, so dass die endgültige Verdünnung der Serumprobe in der Vertiefung das 400-fache beträgt und die endgültige Anzahl der Kügelchen 1000 Kügelchen/Kügelchensatz/50-μl-Reaktion beträgt.
    3. Decken Sie die 96-Well-Reaktionsplatte mit einer Mikrotiterplattenversiegelung (Klebefolie oder Kunststoffplattenabdeckungen) ab.
    4. Die Platte 2 h bei 20 °C bei 750 U/min auf einem Plattenschüttler inkubieren.
  4. Waschen von Perlen
    1. Entfernen Sie die 96-Well-Reaktionsplatte aus dem Plattenschüttler und entfernen Sie vorsichtig die Klebeplattendichtung.
    2. Legen Sie die 96-Well-Reaktionsplatte in eine Plattenwaschanlage.
    3. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 100 μl Waschpuffer (1× PBS + 0,05 % v/v Tween 20) mit dem automatischen magnetischen Plattenwascher.
  5. Resuspendieren Sie die gewaschenen Perlen in 100 μl Waschpuffer, decken Sie die Platte mit Klebefolie oder einer Kunststoffplattenabdeckung ab und schütteln Sie die Platte auf einem Plattenschüttler 1 Minute lang bei 20 °C bei 1000 U/min.
  6. Die gewaschenen Perlen teilen
    1. Entfernen Sie die 96-Well-Reaktionsplatte aus dem Plattenschüttler und entfernen Sie vorsichtig die Klebeplattendichtung.
    2. Mischen Sie Reaktionen, indem Sie fünfmal nach oben und unten pipettieren, und übertragen Sie 50 μl von jedem 100-μl-Reaktionsvolumen auf jede der neuen 96-Well-Reaktionsplatten, eine Platte für den IgG-Nachweis und eine für den IgM-Nachweis.
  7. Inkubation von Nachweisantikörpern/Reagenzien
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt wurden Zielantigen-gekoppelte Beads mit Serumproben inkubiert, um zirkulierende Antikörper im Serum (falls vorhanden) zu extrahieren, die mit dem/den Antigen(en) reagieren. Reagierte Beads mit gebundenem Immunglobulin wurden in zwei Platten aufgeteilt, und IgG und IgM werden nun in ihren separaten Platten mit isotypspezifischen Sekundärantikörpern mit einer PE-Markierung nachgewiesen und quantifiziert. Staffelung des Plattenhandlings um 20 Min.
    1. Saugen Sie den Überstand aus den Vertiefungen mit den Magnetperlen mit dem magnetischen Plattenwäscher ab.
    2. Stellen Sie für jede Platte die geeignete Ig-Detektionsreagenzmischung (entweder Anti-IgG oder Anti-IgM) her, die PE-konjugiertes Ziegen-Anti-Human-IgG (3 μg/ml) oder PE-konjugiertes Esels-Anti-Human-IgM (5 μg/ml) im Assay-Puffer enthält. Für jede Sickenvertiefung werden 30 μl Detektionsreagenz verwendet. Bereiten Sie ausreichende IgG- und IgM-Detektionsreagenzvolumina für Reaktionsvertiefungen vor, mit ausreichend zusätzlichem Volumen, um Pipettierverluste auszugleichen.
    3. Pipettieren Sie 30 μl IgG-Detektionsreagenz in jede Vertiefung, die umgesetzte Kügelchen auf der IgG-Platte enthält, und decken Sie die 96-Well-Reaktionsplatte mit einer Mikrotiterplattendichtung ab.
    4. Pipettieren Sie 30 μl IgM-Detektionsreagenz in jede Vertiefung, die reagierte Kügelchen auf der IgM-Platte enthält, und decken Sie die 96-Well-Reaktionsplatte mit einer Mikrotiterplattendichtung ab.
    5. 45 min bei 20 °C unter Schütteln bei 750 U/min auf einem Plattenschüttler inkubieren.
  8. Waschen von Perlen
    1. Entfernen Sie die 96-Well-Reaktionsplatte aus dem Plattenschüttler und entfernen Sie vorsichtig die Klebeplattendichtung.
    2. Legen Sie die 96-Well-Reaktionsplatte in eine magnetische Plattenscheibe.
    3. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 100 μl Waschpuffer mit der magnetischen Plattenscheibe.
  9. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 μl Waschpuffer.
  10. Analysieren Sie die Ergebnisse auf dem einzelnen Reporterinstrument.
    1. Decken Sie die 96-Well-Reaktionsplatte mit einer Mikrotiterplattendichtung ab.
    2. Die 96-Well-Reaktionsplatte wird 3 Minuten lang bei 20 °C bei 1000 U/min auf einem Plattenschüttler geschüttelt.
    3. Übertragen Sie die 96-Well-Reaktionsplatte aus dem Plattenschüttler und setzen Sie ein Durchflussanalysegerät mit einem Reporter ein (Materialtabelle).
    4. Analysieren Sie für jede Probe die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) mit den folgenden Geräteeinstellungen: Aufnahmevolumen = 80 μl, Anzahl = 50/Kügelchenpopulation, Timeout = 60s, Gating = 7.500-15.000)12,13.

5. Testverfahren: Serologischer Dual-Reporter-IgG- und IgM-Test: 96-Well-Format

  1. Probenverdünnung (2 Schritte, beide in 96-Well-Platten; 200-fache Serumprobenverdünnung im Assay-Puffer)
    1. Probenverdünnung Schritt 1: Mischen Sie 5 μl Serumprobe mit 120 μl Assay-Puffer (25-fache Verdünnung).
    2. Probenverdünnung Schritt 2: Verdünnen Sie die 25-fache Probenverdünnung um das weitere 8-fache, indem Sie 10 μl der ersten Verdünnung (25-fach verdünnte Probe aus Abschnitt 5.1.1) mit 70 μl Assay-Puffer (8-fache Verdünnung) mischen, um eine endgültige Probenverdünnung auf das 200-fache zu erhalten.
  2. Verdünnung der magnetischen Perlenmischung
    1. Bereiten Sie eine Kügelchenmischung vor, die 1,0 ×10 6 Zielantigen-gekoppelte Kügelchen/ml pro Kügelchenpopulation (d. h. pro eindeutigem Zielantigen) enthält.
      HINWEIS: In dieser experimentellen Serie haben wir sowohl die IgG- als auch die IgM-Immunreaktivität gegen vier einzigartige Borrelien-Antigene in jeder Reaktion untersucht.
    2. Die vorbereitete Kügelchenmischung wird 50-fach in Assay-Puffer verdünnt. Die Kügelchenkonzentration in dieser verdünnten Suspension beträgt nun 2,0 × 104 Kügelchen/ml pro Kügelchenpopulation.
      HINWEIS: Die Anzahl der Kügelchen in der Duplex-Assay-Reaktion wird im Vergleich zur Einzelreporterreaktion halbiert, um eine direkte Vergleichbarkeit zwischen den beiden Assays zu ermöglichen und Ressourcen zu schonen, nachdem vorläufige Studien bestätigt haben, dass das Fluoreszenzsignal innerhalb des linearen Quantifizierungsbereichs gehalten wurde, wenn die Hälfte der Anzahl von Kügelchen verwendet wurde.
  3. Inkubation von Serumproben mit Beads
    1. Pipettieren Sie 25 μl verdünnte antigengekoppelte Ziel-Bead-Suspension (enthält 2,0 × 104 Beads/Set/ml) in vorab zugewiesene Vertiefungen einer 96-Well-Halbflächen-Mikrotiterplatte. Die genaue Anzahl der Reaktionsvertiefungen und ihre Platzierung auf der Platte hängen von der vom Bediener bestimmten Gesamtzahl der getesteten Proben ab und davon, ob Einzel- oder Wiederholungsvertiefungen pro Probe durchgeführt werden.
      HINWEIS: Die antigengekoppelten magnetischen Kügelchen werden mit humanen Serumproben umgesetzt. Sowohl das immunreaktive Anti-Borrelien-Antigen IgG als auch das IgM, sofern in Proben vorhanden, binden an dieselben Antigen-gekoppelten Beads und werden auf ihnen immobilisiert. Die Quantifizierung von gebundenem IgG und IgM durch Sekundärantikörper wird dann an denselben Kügelchen in denselben Reaktionen durchgeführt, wobei verschiedene Fluorophore zur Identifizierung von IgG und IgM verwendet werden, die ihre Differenzierung ermöglichen.
    2. 25 μl 200-fach verdünntes Serum (aus Schritt 5.1 oben) in jede Vertiefung mit 25 μl gemischter antigengekoppelter Bead-Suspension (Schritt 5.2) geben.
      HINWEIS: Dies führt zu einer zusätzlichen 2-fachen Verdünnung, so dass die endgültige Verdünnung der Serumprobe in der Vertiefung 400-fach beträgt und die endgültige Anzahl der Kügelchen 500 Kügelchen/Kügelchensatz/50-μl-Reaktion beträgt.
    3. Decken Sie die 96-Well-Reaktionsplatte mit einer Mikrotiterplattenversiegelung (Klebefolie oder Kunststoffplattenabdeckung) ab.
    4. Platte mit Perlen 2 h bei 20 °C bei 750 U/min auf einem Plattenschüttler inkubieren.
  4. Waschen von Kügelchen (um überschüssige Serumprobe zu entfernen)
    1. Entfernen Sie die 96-Well-Reaktionsplatte vom Plattenschüttler und entfernen Sie die Klebeplattendichtung.
    2. Legen Sie die 96-Well-Reaktionsplatte in eine magnetische Plattenscheibe.
    3. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 100 μl Waschpuffer mit der magnetischen Plattenscheibe.
  5. Saugen Sie das endgültige Waschvolumen nach dem letzten Waschschritt von den Perlen ab.
  6. Nachweis von Antikörpern (Inkubation - Teil I)
    1. Stellen Sie frisches IgG- und IgM-Doppeldetektionsreagenz her, das biotinyliertes Ziegen-Anti-Human-IgG (1 μg/ml) zusammen mit PE-konjugiertem Esels-Anti-Human-IgM (5 μg/ml) in Assay-Puffer enthält. Für jedes Kügelchen, das die Vertiefung enthält, werden 30 μl Dual-Detektionsreagenz verwendet. Bereiten Sie ausreichende IgG- und IgM-Reagenzvolumina mit doppelter Detektion für Reaktionsvertiefungen vor, mit ausreichend zusätzlichem Volumen, um Pipettierverluste auszugleichen.
    2. Pipettieren Sie 30 μl IgG- und IgM-Doppeldetektionsreagenz in jede zugewiesene Vertiefung und bedecken Sie die 96-Well-Reaktionsplatte mit einer Mikrotiterplattendichtung.
    3. Die Platte 45 min bei 20 °C inkubieren und dabei bei 750 U/min auf einem Plattenschüttler schütteln.
  7. Waschen von Kügelchen (um überschüssige Nachweisantikörper zu entfernen)
    1. Entfernen Sie die 96-Well-Reaktionsplatte aus dem Plattenschüttler und entfernen Sie vorsichtig die Klebeplattendichtung.
    2. Legen Sie die 96-Well-Reaktionsplatte in eine automatische magnetische Plattenwaschanlage.
    3. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 100 μl Waschpuffer mit der automatischen magnetischen Plattenwaschmaschine.
  8. Saugen Sie das endgültige Waschvolumen nach dem letzten Waschschritt von den Perlen ab.
  9. Streptavidin-konjugierter Reporter (Inkubation - Teil II)
    1. Verdünnen Sie frisches, BV421-markiertes Streptavidin in einem Assay-Puffer auf eine Konzentration von 0,2 μg/ml. Für jede Vertiefung mit Kügelchen werden 30 μl BV421-markiertes Streptavidin verwendet. Bereiten Sie ein ausreichendes BV421-markiertes Streptavidin-Volumen für Reaktionsvertiefungen vor, mit ausreichend zusätzlichem Volumen, um Pipettierverluste auszugleichen.
    2. Pipettieren Sie 30 μl verdünntes BV421-Streptavidin in jede Reaktionsvertiefung und decken Sie die 96-Well-Reaktionsplatte mit der Mikrotiterplattendichtung ab.
    3. Die Platte 30 min bei 20 °C inkubieren und dabei bei 750 U/min auf einem Plattenschüttler schütteln.
  10. Waschperlen (um überschüssiges BV421-Streptavidin zu entfernen)
    1. Entfernen Sie die 96-Well-Reaktionsplatte aus dem Plattenschüttler und entfernen Sie vorsichtig die Klebeplattendichtung.
    2. Legen Sie die 96-Well-Reaktionsplatte in die magnetische Plattenscheibe.
    3. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 100 μl Waschpuffer mit der automatischen magnetischen Plattenwaschmaschine.
  11. Resuspendieren Sie die Kügelchen in Vertiefungen auf ein Endvolumen von 100 μl im Waschpuffer.
  12. Analysieren Sie die Ergebnisse auf dem Dual-Reporter-Instrument
    1. Decken Sie die 96-Well-Reaktionsplatte mit einer Mikrotiterplattendichtung ab.
    2. Die 96-Well-Reaktionsplatte wird 3 Minuten lang bei 20 °C bei 1000 U/min auf einem Plattenschüttler inkubiert.
    3. Übertragen Sie die 96-Well-Reaktionsplatte vom Plattenschüttler auf das Durchflussanalysatorgerät mit zwei Reportern (Materialtabelle).
    4. Bewerten Sie die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers (Geräteeinstellungen: Dual-Reporter-Modus, Aufnahmevolumen = 80 μl, Anzahl = 50/Kügelchenpopulation, Timeout = 60 s, Gating = 7.500-15.000).

6. Serologischer Dual-Reporter-IgG- und IgM-Assay: halbautomatisches 384-Well-Format

  1. Führen Sie den Dual-Reporter-Assay im 384-Well-Plattenformat mit den in Abschnitt 5 beschriebenen Assay-Schritten durch, aber verarbeiten Sie die Proben mit einem Pipettierroboter und einer automatisierten magnetischen Plattenwaschanlage (Materialtabelle). Im 384-Well-Format schütteln Sie die Platten während der Inkubation und des Waschens bei 1450 U/min und schütteln Sie die Platte vor der Messung der Fluoreszenz 5 Minuten lang bei 21 °C und 1800 U/min.

Repräsentative Ergebnisse

Experimenteller Überblick
Die allgemeinen Schemata für die Borrelien-Assays auf Basis von Einzel- und Doppelreporterkügelchen sind in Abbildung 1 dargestellt. Für einzelne Antikörperziele (d. h. IgG oder IgM), die gegen ein bestimmtes Borrelien-Antigen generiert wurden, wurden beide Antikörperklassen unabhängig voneinander in humanen Serumproben unter Verwendung eines PE-konjugierten Anti-Isotyp-Antikörpers für die Berichterstattung bewertet. Für den Dual-Reporter-Assay mit gleichzeitiger Analyse der IgG- und IgM-Immunreaktivität wurde für den Borrelien-Antigen-spezifischen IgG-Nachweis ein biotinyliertes Anti-Human-IgG + BV421-markiertes Streptavidin-Reportersystem (blaue Fluoreszenz) verwendet, während der PE-konjugierte Reporter (orangefarbene Fluoreszenz) für den IgM-Nachweis beibehalten wurde. Der Arbeitsablauf des Dual-Reporter-Assays ähnelt dem des Single-Reporter-Assays, mit Ausnahme einer zusätzlichen 30-minütigen Inkubation des Detektionssystems mit dem Zweikanal-Fluoreszenzdetektionsreagenz BV421-Streptavidin.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Borrelien-Assays auf Basis von Einzel- und Doppelreporterkügelchen. (A) Das Einzelreporter-Instrument wurde verwendet, um den Bead-basierten Assay zu entwickeln und zunächst zu validieren, der entweder Anti-Borrelien-IgG oder IgM einzeln charakterisierte, wobei beide eine Phycoerythritin (PE)-Fluoreszenz-Reportermarkierung verwendeten, die Signale in den "orangen" Spektren emittiert. Jedes gewünschte Borrelien-Antigen kann an die Kügelchen gekoppelt und verwendet werden, um entweder IgG oder IgM in Serumproben zu erfassen und zu quantifizieren. Zwei separate Immunoassays sind erforderlich, um sowohl die IgG- als auch die IgM-Reaktivität gegen ein bestimmtes Antigen zu bewerten. (B) Das Dual-Reporter-System ermöglichte die gleichzeitige Analyse von Serumproben auf IgG- und IgM-Antikörper gegen ein einzelnes Borrelien-Antigen im selben Well. Bei diesem Ansatz wird derselbe PE-konjugierte Nachweisantikörper verwendet, um auf Anti-Borrelien-IgM abzuzielen, ersetzt jedoch den IgG-Nachweis von einem PE-basierten System durch die Verwendung eines biotinylierten Primärnachweisantikörpers und BV421-markierten Streptavidins (ein "blauer" Emitter), der einen zusätzlichen Inkubationsschritt des Nachweissystems von 30 Minuten erfordert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Präzision innerhalb des Assays
Die Spearman-Korrelationsanalyse für drei repräsentative Borrelien-Antigene (Abbildung 2) zeigte eine einheitliche Reproduzierbarkeit der MFI-Werte beim Nachweis von Anti-Borrelien-Antikörpern in humanen Seren.

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Abbildung 2: Intra-Assay-Präzision des Dual-Reporter-Bead-basierten Borrelien-Assays . Die Korrelationsanalyse von Spearman zeigte eine hohe Intra-Assay-Präzision des Dual-Reporter-Assays, wenn ein PE-Detektionssystem zum Nachweis von Borrelien-spezifischen IgM-Antikörpern (A) und ein BV421-Detektionssystem zum Nachweis von Borrelien-spezifischen IgG-Antikörpern (B, C) verwendet wurde. Insgesamt wurden 21 Serumproben in Dubletten mit einem halbautomatischen Verfahren analysiert. In jeder Grafik wurden die MFI-Signale gegeneinander aufgetragen und mittels linearer Regression analysiert. Eine lineare Kurve (x=y), die als rot gestrichelte Linie dargestellt ist, zeigt identische MFI-Signale für Detektionssysteme an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Präzision zwischen den Assays
Eine gute Reproduzierbarkeit von Assay zu Assay wurde mit dem Dual-Reporter-Assay beobachtet. Levey-Jennings-Diagramme (Abbildung 3) mit MFI-Werten einer Qualitätskontrollprobe, die über sieben unabhängige Läufe gemessen wurden, zeigten die hohe Inter-Assay-Präzision für alle repräsentativen Antigene. Der durchschnittliche prozentuale Variationskoeffizient (CV% = Standardabweichung/Mittelwert × 100) der vier repräsentativen Borrelien-Antigene betrug 5,3 %.

Linearität der Verdünnung
Da der ursprüngliche Single-Reporter-Assay und der neue Dual-Reporter-Assay unterschiedliche durchflusszytometrische Plattformen verwenden, verglichen wir die medianen Fluoreszenzergebnisse desselben Antigen-Immunoassays zwischen den beiden Durchflusszytometrie-Instrumenten (Abbildung 4). Die Probenverdünnungsreihen lieferten lineare Verdünnungskurven sowohl für die IgM- als auch für die IgG-Bewertung, mit einer guten Parallelität der Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen den Instrumenten über den gesamten untersuchten Verdünnungsbereich (1:100-1:12.800).

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Abbildung 3: Inter-Assay-Präzision des Dual-Reporter-Bead-basierten Borrelien-Assays . Für die Bewertung der Inter-Assay-Präzision wurde die Borrelien-spezifische IgM (A) und IgG (B-D) Antikörperantwort einer Qualitätskontrollprobe über sieben unabhängige Durchläufe analysiert, jeweils in doppelten Wells. Die Analysen wurden manuell durchgeführt. Die MFI-Werte wurden in einem Levey-Jennings-Diagramm dargestellt. Eine grüne Linie gibt den Mittelwert aller Werte an. Zwei rot gestrichelte Linien zeigen den Toleranzbereich der Präzision zwischen den Assays an. Diese wurde aus dem Mittelwert ± 2,5-fachen der Standardabweichung (2,5 S.D.) berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Verdünnungslinearität des Borrelien-Assays auf Dual-Reporter-Bead-Basis. Bei Probenverdünnungen von 100-fach bis 12.800-fach waren die Verdünnungskurven sowohl für den IgM-Nachweis (A) als auch für den IgG-Nachweis (B) ähnlich, wenn sie manuell mit dem Einzelreportergerät und dem Doppelreportergerät durchgeführt wurden. Bei allen getesteten Verdünnungen waren die MFI-Werte mit dem Single-Reporter-Instrument (rote Symbole) etwas höher als mit dem Dual-Reporter-Instrument (blaue Symbole). Dargestellt sind Verdünnungskurven für 2 repräsentative Antigene, wobei jeder Verdünnungspunkt die durchschnittliche Messung von Dreifachvertiefungen mit Standardabweichung (SD *) darstellt, die durch Fehlerbalken angezeigt wird. Hinweis: Kleine SDs sind in diesem Maßstab nicht sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Materialien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

In diesem Bericht wird die Entwicklung eines auf zwei Reporterkügelchen basierenden Borrelien-Immunoassays vorgestellt, der die Anti-Borrelien-Immunreaktivität in Serumproben reproduzierbar und sensitiv bestimmt12. Die verschiedenen pathogenen Borrelienarten, die die Lyme-Borreliose verursachen, können durch variantenspezifische Antigenheterogenität unterschiedenwerden 6,7,8,9. Der Multiplex-Assay wertet gleichzeitig die IgG- und IgM-vermittelte Anti-Borrelien-Immunreaktivität innerhalb derselben Reaktionsvertiefung aus, wodurch Reagenzien, Arbeitskräfte und Probenmaterial eingespart werden, die sonst für die separate Durchführung von zwei Singleplex-Assays erforderlich wären. Der Vergleich von IgM- und IgG-Antworten im Laufe der Zeit könnte eine bessere Verfolgung des Krankheitsverlaufs ermöglichen, da die Serokonversion von IgM zu IgG nach einer Infektion stattfindet6.

Das Dual-Reporter-System verwendet zwei verschiedene Detektionsantikörpersysteme13,15. Verwandte Experimente zeigten keine signifikante nachweisbare Kreuzreaktivität zwischen Borrelien-Anti-IgM- und Anti-IgG-Detektionssystemen, wenn beide Antikörperklassen zusammen im selben Reaktionswell analysiert wurden12. In Anbetracht der geringeren Bindungsaffinität von IgM- im Vergleich zu IgG-Antikörpern16,17 wählten wir einen PE-konjugierten Detektionsantikörper für den IgM-Nachweis (der erste Reporterkanal des Dual-Reporter-Instruments), da PE einer der am stärksten emittierenden Fluorophore ist, die routinemäßig in Immunoassays verwendet werden18. Für die IgG-Evaluierung verwendeten wir einen biotinylierten Detektionsantikörper, der anschließend mit BV421-konjugiertem Streptavidin (dem zweiten Reporterkanal des Instruments) beleuchtet wurde19. Trotz des zusätzlichen 30-minütigen Inkubationsschritts im Vergleich zum Single-Reporter-System liefert das Dual-Reporter-System die doppelte Information pro Reaktion. Insgesamt erfordert der Multiplex-Assay mit zwei Reportern weniger kumulativen Zeit- und Materialaufwand als die Durchführung von Assays mit zwei einzelnen Reportern.

Die starke Leistung und Stabilität des gemultiplexten Borrelien-Assays wurde durch eine hohe Reproduzierbarkeit in Intra- und Inter-Assay-Präzisionsstudien sowie durch den Nachweis der Verdünnungslinearität und Verdünnungsparallelität über einen breiten Bereich von Probenkonzentrationen sowohl für die IgG- als auch für die IgM-Bewertung veranschaulicht. Wir beobachteten höhere absolute Fluoreszenzemissionswerte für die gleichen Fluorophore mit dem Einkanal-Gerät im Vergleich zum Zweikanal-System (≈1,7 × höher mit PE), was auf Unterschiede in der Optik und den Kalibrierungseinstellungen zwischen den beiden Instrumenten zurückzuführen ist (Abbildung 4). Nichtsdestotrotz blieben die Fluoreszenzemissionskurven mit beiden Fluorophoren bei hohen und niedrigen Probenverdünnungsextremen innerhalb des linearen Bereichs beider Instrumente, und eine Diskrepanz in der gemessenen absoluten Fluoreszenz hatte keinen Einfluss auf die Klassifizierung des Borrelien-Expositionsstatus . 12

Ein großer Vorteil dieses Bead-basierten Borrelien-Multiplex-Assays ist die Leichtigkeit, mit der der Assay modifiziert oder erweitert werden kann, um verschiedene oder zusätzliche Analyten zu evaluieren, z.B. um Antikörper gegen Antigene weiterer Borrelienspezies nachzuweisen. xMAP-Magnetbead-Sets enthalten verschiedene Farbstoffkombinationen, die im Klassifikationskanal des Geräts unterschieden werden können und theoretisch in Multiplex-Assays implementiert werden können, die gleichzeitig bis zu 500 einzigartige Analyten in derselben Probe auswerten können. Während in der aktuellen Studie vier repräsentative Borrelien-Antigene hervorgehoben werden, um die Funktionalität und Stabilität des Assays zu demonstrieren und das Single- und Dual-Reporter-System zu vergleichen, werden im finalen Assay acht Antigene abgefragt, die zusammen alle fünf klinisch relevanten Borrelien-Erreger identifizieren können, die in Europa und Nordamerika zirkulieren12.

Eine hohe Durchsatzleistung ist mit Standard-384-Well-Mikrotiterplatten in einem halbautomatischen Assay-Format möglich. Die Kompatibilität des Assays und der Geräte mit 96- und 384-Well-Platten ermöglicht den Einsatz des Borrelien-Multiplex-Assays als effizientes Screening-Tool für die schnelle Analyse großer Probensätze, wie z. B. nationale Studien20. Die manuelle Durchführung des Assays bleibt für kleinere Probensätze mit kleineren 96-Well-Platten möglich.

Zu den Einschränkungen der Studie gehört die vergleichende Bewertung von nur wenigen Borrelien-Immunreaktivitätszielen in einer kleinen Anzahl von humanen Serumproben. Die ursprüngliche Studie bestätigte jedoch, dass die Assay-Leistung sowohl für IgG als auch für IgM beibehalten wurde, wenn acht Antigene aus allen fünf bekannten Borrelienarten innerhalb eines größeren Stichprobensatzes analysiert wurden12. Außerdem kann das Dual-Reporter-Gerät innerhalb jeder Reaktion nur zwei Antikörper-Isotypen gleichzeitig bewerten, so dass für eine vollständige Isotyp-Profilierung zusätzliche Assay-Reaktionen erforderlich wären13.

Zusammenfassend beschreibt dieser Bericht die erfolgreiche Fusion und Umwandlung von Bead-basierten Single-Reporter-Immunoassays in Dual-Reporter-Assays, die gleichzeitig pathogene Borrelien-spezifische IgG- und IgM-Antikörper in humanen Serumproben evaluieren können. Dieser kombinierte Ansatz spart insgesamt Zeit, Material und Arbeitsaufwand, um das gleiche Datenvolumen wie zwei unabhängige Einzelreporter-Assays zu generieren. Der Multiplex-Assay kann vom 96-Well- bis zum 384-Well-Mikrotiterplattenformat skaliert werden und kann durch den Einsatz von Roboterplatten und Liquid-Handling-Instrumenten halbautomatisiert werden, wodurch er für Hochdurchsatzanwendungen wie große Bevölkerungsumfragen geeignet ist. Bead-basierte Dual-Reporter-Assay-Systeme haben sich bereits in der Vergangenheit als nützlich erwiesen, um beispielsweise Immunantworten auf andere virale und bakterielle Krankheitserregerzu bewerten 13,21, allogene Antikörperantworten gegen HLA-Epitope bei Organtransplantationenzu bewerten 22 und Mechanismen von Autoimmunerkrankungenzu erforschen 23. Der aktuelle Bericht beschreibt den Einsatz der Multiplex-Technologie zur Identifizierung der Exposition gegenüber den Borrelien-Erregern, die die Lyme-Borreliose verursachen, als Beispiel dafür, wie Labore diesen Ansatz zur Erforschung komplexer Immunmechanismen bei verschiedenen Pathologien anpassen können.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Dieser Bericht wurde von Luminex (Austin, TX) finanziert. Die Autoren danken Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) für die analytische und wissenschaftliche Unterstützung bei der Redaktion. Die Autoren danken auch Harald Klein und Christoph von Eichel-Streiber von der tgcBIOMICS GmbH (Bingen, Deutschland) für die Bereitstellung der in der Studie verwendeten Borrelien-Antigene . Humane Serumproben für die technische Assay-Validierung und Qualitätskontrolle wurden gewonnen aus: 1) der multilokalen und seriellen Prävalenzstudie zu Antikörpern gegen SARS-CoV-2 in Deutschland über die Abteilung Epidemiologie, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig, Deutschland; und 2) die Klinik für Neurologie, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (Rodewisch, Deutschland). Die Genehmigung für die Verwendung humaner Proben wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover erteilt (9086_BO_S_2020).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies and Detection ReagentsSourceCatalog Number
Biotinylated Goat Anti-Human IgGJackson ImmunoResearch (Dianova)109-066-098 
Brilliant Violet 421-StreptavidinBD Biosciences563259
Donkey Anti-Human IgM Jackson ImmunoResearch (Dianova)709-116-073
Borrelia AntigenstgcBIOMICS (Bingen, Germany)
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)Thermo Scientific Pierce77149 ProteoChem (100 mg)
10x PBSFisher ScientificBP399-4
BSACarl RothT844.3
MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer)Carl Roth4256.2
Na2HPO4Carl Roth4984.1
ProClin300Sigma48914-U
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)Thermo Scientific Pierce24510 (500 mg)
Triton X-100Thermo Scientific85111
Instrumentation and Ancillary Lab SuppliesSource
384-well plateCorning, Cat# 3570
96-well deep-well platesThermoFisher Scientific, Cat# 95040450
96-well half-area plates Corning, Cat# 3690
BioTek 405 TS Plate WasherBioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
BioTek MultiFlo FX Plate WasherBioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes)ThermoFisher, Cat# 12320D
Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument)Luminex Corp., Austin, TX
KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates) ThermoFisher, Cat# A31508
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads)Luminex Corp., Austin, TX
SmartBlock PlatesEppendorf, Cat# 5363000039
ThermoMixer CEppendorf, Cat# 5382000015
ThermoTopEppendorf, Cat# 5308000003
xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument)Luminex Corp., Austin, TX

Referenzen

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