Messung desO2-Verbrauchs in Drosophila melanogaster mittels coulometrischer Mikrorespirometrie

Zusammenfassung

Die coulometrische Respirometrie ist ideal für die Messung der Stoffwechselrate kleiner Organismen. Bei der Adaption für Drosophila melanogaster in der vorliegenden Studie lag der gemessene_O2-Verbrauch innerhalb des Bereichs, der in früheren Studien für Wildtyp D. melanogaster berichtet wurde. Der_O2-Verbrauch pro Fliege war bei CASK-Mutanten , die kleiner und weniger aktiv sind, signifikant niedriger als beim Wildtyp.

Zusammenfassung

Die coulometrische Mikrorespirometrie ist eine einfache, kostengünstige Methode zur Messung des_{O2-Verbrauchs} kleiner Organismen bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung eines stabilen Milieus. Ein coulometrisches Mikrorespirometer besteht aus einer luftdichten Kammer, in der O2 verbraucht und das vom Organismus produzierte_CO2 durch ein absorbierendes Medium entfernt wird. Der resultierende Druckabfall löst die elektrolytische_{O2-Produktion} aus, und die Menge an erzeugtem_O2 wird gemessen, indem die Menge der Ladung aufgezeichnet wird, die zu ihrer Erzeugung verwendet wurde. In der vorliegenden Studie wurde die Methode an Drosophila melanogaster angepasst, die in kleinen Gruppen getestet wurde, wobei die Empfindlichkeit der Apparatur und die Umgebungsbedingungen für eine hohe Stabilität optimiert wurden. Die Menge an_O2, die von Wildtyp-Fliegen in diesem Apparat verbraucht wird, stimmt mit der in früheren Studien gemessenen Menge überein. Der massenspezifische_O2-Verbrauch von CASK-Mutanten, die kleiner sind und von denen bekannt ist, dass sie weniger aktiv sind, unterschied sich nicht von kongenen Kontrollen. Die geringe Größe der CASK-Mutanten führte jedoch zu einer signifikanten Reduzierung des_{O2-Verbrauchs} pro Fliege. Daher ist das Mikrorespirometer in der Lage, den_O2-Verbrauch in D. melanogaster zu messen, kann bescheidene Unterschiede zwischen Genotypen unterscheiden und ist ein vielseitiges Werkzeug zur Messung der Stoffwechselraten.

Einleitung

Die Fähigkeit, die Stoffwechselrate zu messen, ist entscheidend für ein vollständiges Verständnis eines Organismus in seinem Umweltkontext. Zum Beispiel ist es notwendig, die Stoffwechselrate zu messen, um ihre Rolle in der Lebensspanne¹, die Rolle der Ernährung im Stoffwechsel² oder die Schwelle für hypoxischen Stress³ zu verstehen.

Es gibt zwei allgemeine Ansätze zur Messung der Stoffwechselrate⁴. Die direkte Kalorimetrie misst den Energieverbrauch direkt durch die Messung der Wärmeproduktion. Die indirekte Kalorimetrie misst die Energieerzeugung auf andere Weise, oft durch respirometrische Messung des O2-Verbrauchs (V_O2), der CO_{2 -}Produktion oder beidem. Obwohl die direkte Kalorimetrie bei kleinen Ektothermen, einschließlich Drosophila melanogaster⁵, angewendet wurde, ist die Respirometrie technisch einfacher und wird häufiger verwendet.

Verschiedene Formen der Respirometrie wurden erfolgreich zur Messung der Stoffwechselrate bei Wildtyp- und mutierten D. melanogaster eingesetzt und haben Einblicke in die metabolischen Auswirkungen von Temperatur⁶, sozialem Umfeld 3, Ernährung^{3, 7 und} neurologischen Entwicklungsstörungen⁸ gegeben. Diese lassen sich in zwei Klassen einteilen, die sich in Kosten und Komplexität erheblich unterscheiden. Die Manometrie ist die einfachste und kostengünstigste ^9,10, bei der die Fliegen in eine geschlossene Kammer gesetzt werden, die ein_{CO2-Absorptionsmittel} enthält und über eine dünne Kapillare mit einem Flüssigkeitsreservoir verbunden ist. Wenn_O2 verbraucht und_CO2 absorbiert wird, sinkt der Druck in der Kammer und Flüssigkeit wird in die Kapillare gesaugt. Das flüssigkeitsgefüllte Volumen der Kapillare ist also proportional zu V_O2. Aufwendigere Versionen, die die Kraft der Flüssigkeit in der Kapillare kompensieren, wurden auch bei D. melanogaster¹ eingesetzt. Die Manometrie hat den Vorteil, dass sie einfach und kostengünstig ist, aber da sie druckempfindlich ist, erfordert sie konstante Umgebungsbedingungen. Da das verbrauchte O2 nicht ersetzt wird, nimmt der Partialdruck von O2 (_PO2) in den Kammern allmählich ab.

Auch die Respirometrie mittels Gasanalyse wird regelmäßig bei D. melanogaster eingesetzt. In diesem Fall werden Gase in regelmäßigen Abständen aus versiegelten Kammern, die Fliegen enthalten, entnommen und an einen Infrarot-Analysator ^2,6,11 geschickt. Diese Art von Apparatur hat den Vorteil, dass sie im Handel erhältlich ist, weniger empfindlich auf Umweltbedingungen reagiert und Gase während der Probenahme aufgefrischt werden, so dass P_O2 stabil bleibt. Die Geräte können jedoch teuer und komplex im Betrieb sein.

Ein kürzlich entwickeltes coulometrisches Mikrorespirometer¹² bietet eine kostengünstige, empfindliche und stabile Alternative zu bestehenden Systemen. In der Praxis wird ein Organismus in eine luftdichte Kammer gebracht, wo er O2 verbraucht und das ausgeatmete_CO2 durch ein absorbierendes Material entfernt wird, was zu einer Nettoabnahme des Kammerdrucks führt. Wenn der Innendruck auf einen voreingestellten Schwellenwert (ON-Schwelle) sinkt, wird Strom durch einen elektrolytischen_O2-Generator geleitet, der den Druck auf einen zweiten Schwellenwert (OFF-Schwelle) zurückführt und die Elektrolyse stoppt. Die Ladungsübertragung über den O2-Generator ist direkt proportional zu der Menge an O2, die erforderlich ist, um die Kammer wieder unter Druck zu setzen, und kann daher verwendet werden, um das vom Organismus⁴ verbrauchte_O2 zu messen. Die Methode ist hochempfindlich, misst V O2 präzise, und der regelmäßige Austausch von O2 kann P_O2 über Stunden oder Tage auf einem nahezu konstanten Niveau halten.

Das coulometrische Mikrorespirometer, das in dieser Studie verwendet wird, verwendet einen multimodalen (Druck, Temperatur und Feuchtigkeit) elektronischen Sensor. Der Sensor wird von einem Mikrocontroller betrieben, der kleine Druckänderungen erkennt und bei Erreichen einer niedrigen Druckschwelle^{12 die O2-Generation} aktiviert. Diese Apparatur wird aus handelsüblichen Teilen zusammengebaut, kann mit einer Vielzahl von Kammern und Versuchsumgebungen verwendet werden und wurde erfolgreich eingesetzt, um die Auswirkungen von Körpermasse und Temperatur auf den Käfer Tenebrio molitor zu untersuchen. In der vorliegenden Studie wurde das Mikrorespirometer angepasst, um den_O2-Verbrauch in D. melanogaster zu messen, der etwa 1% der Masse von T. molitor aufweist. Die Empfindlichkeit der Apparatur wurde erhöht, indem die Schwelle für die Aktivierung der_O2-Erzeugung gesenkt wurde, und die Umgebungsstabilität wurde durch die Durchführung von Experimenten in einem temperaturgesteuerten Wasserbad und durch die Aufrechterhaltung der Luftfeuchtigkeit in den Kammern bei oder nahe 100 % erhöht.

Das CASK-Protein (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), das zur Familie der membranassoziierten Guanylatkinasen (MAGUK) gehört, ist ein molekulares Gerüst in verschiedenen Multiproteinkomplexen, und Mutationen in CASK sind mit neurologischen Entwicklungsstörungen beim Menschen und bei D. melanogaster assoziiert ^13,14. Eine lebensfähige D. melanogaster-Mutante, CASK^Δ18, stört die Aktivität dopaminerger Neuronen 15 und reduziert das Aktivitätsniveau um mehr als 50 % im Vergleich zu kongenen Kontrollen^14,16. Aufgrund der reduzierten Aktivität von CASK-Mutanten und der Rolle von Katecholaminen bei der Regulierung des Stoffwechsels¹⁷ stellten wir die Hypothese auf, dass ihre Standardstoffwechselrate und damit der_O2-Verbrauch im Vergleich zu Kontrollen dramatisch reduziert wäre.

Der O2-Verbrauch wurde in CASK^Δ18 und ihren_{Wildtyp-Artgenossen} w(ex33) gemessen. Gruppen von Fliegen wurden in Respirometriekammern gesetzt, der O2-Verbrauch wurde gemessen, der_O2-Verbrauch wurde berechnet und sowohl massenspezifisch als auch pro Fliege ausgedrückt. Die Apparatur zeichnete V O2 in Wildtyp-Fliegen auf, was mit früheren Studien übereinstimmte, und sie konnte zwischen dem_O2-Verbrauch pro Fliege von Wildtyp- und CASK-mutierten Fliegen unterscheiden.

Protokoll

1. Fliegenaufzucht und -sammlung

1. Halten Sie Fliegen bei 25 °C in schmalen Fläschchen mit Standardfutter für Drosophila .
   HINWEIS: Die Probengröße für jeden Genotyp sollte mindestens neun Wiederholungen umfassen, die jeweils aus einer einzigen Respirometerkammer mit 15-25 Fliegen bestehen, die wie unten beschrieben eingerichtet sind.
2. Transferieren Sie die Fliegen alle 2-3 Tage.
3. Betäuben Sie Fliegen mit CO₂, sammeln Sie Gruppen von 15-25 Männchen jedes Genotyps und legen Sie jede Gruppe in frische, nicht hefehaltige Futterfläschchen.
   HINWEIS: Männchen wurden verwendet, um die Variabilität aufgrund des Fortpflanzungsstatus zu reduzieren. Die Methode gilt für beide Geschlechter.
4. Lassen Sie die Fliegen mindestens 24 Stunden lang bei 25 °C ruhen.
   HINWEIS: Zum Zeitpunkt des Experiments sollten die Fliegen 1-4 Tage alt sein. Die in Schritt 1.3 beschriebene Häufigkeit der Entnahme kann so eingestellt werden, dass der Altersbereich der Fliegen eingegrenzt wird.

2. Aufbau und Montage der Respirometerkammer

1. Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie es auf die gewünschte Temperatur für das Experiment ein.
   HINWEIS: Die folgenden Experimente wurden bei 25 °C mit 50-ml-Schlenk-Röhrchen als Kammern durchgeführt. Die Komponenten sind wie in den Abbildungen 1A, 1B und 1C dargestellt zusammenzubauen.
2. Reinigen Sie die Schlifffugen der Kammern und Sensorstopfen gründlich, indem Sie 70%iges Ethanol auf ein Labortuch (nicht direkt auf die Fuge) sprühen und Staub und altes Fett vom Sensorstopfen wischen (Abbildung 1A). Wischen Sie Ethanol mit einem frischen Labortuch ab.
3. Legen Sie 1 cm dickes Stück Watterolle, die in gereinigtem Wasser getränkt ist, in den Boden der Kammer, um die Luftfeuchtigkeit zu stabilisieren.
   1. Füge so viel Wasser hinzu (~0,5 ml), dass eine kleine Lache am Boden der Watterolle entsteht.
4. Wischen Sie jegliches Wasser ab, das auf die Fuge der Kammer verschüttet wurde.
5. Die Fliegen mit einem Trichter in beschriftete Polypropylen-Röhrchen umfüllen.
   1. Verstopfen Sie den Schlauch mit einer Watterolle.
      HINWEIS: Die Röhrchen bestehen aus einem 5-ml-Reagenzglas aus Polypropylen, das auf eine Länge von 5,5 cm getrimmt und mit einem heißen Messer perforiert wurde, um den freien Luftaustausch mit der Versuchskammer zu ermöglichen. Es ist bekannt, dass die CO_{2 -} Anästhesie Stoffwechselstörungen verursacht, so dass Fliegen ohne Anästhesie übertragen werden, was mehr Sorgfalt erfordert, um den Verlust der Fliegen zu vermeiden.
6. Fügen Sie einen belüfteten Schlauch mit Fliegen in jede Atemschutzkammer (auf nasse Baumwolle) ein.
7. Füllen Sie Kalk-Natronkartuschen (4-5 Pellets pro Röhrchen) und legen Sie sie auf die Oberseite des Röhrchens mit den Fliegen in der Kammer.
   HINWEIS: Kalk-Natronkartuschen bestehen aus 800-μl-Zentrifugenröhrchen, die 4-5 Mal mit einer Bohrmaschine perforiert werden.
8. O2-Generatoren mit gesättigter Kupfersulfatlösung (CuSO₄) unterhalb der Höhe der Entlüftungslöcher füllen
   HINWEIS: O_{2-Generatoren} bestehen aus Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss und 4 Löchern, die unterhalb der Gewinde gebohrt sind. Platin- (Pt) und Kupferelektroden (Cu) werden an zweipolige Steckverbinder gelötet, in Löcher in die Kappe gebohrt und mit Epoxidharz befestigt. Die Elektrolyse von_CuSO4 erzeugt das_O2 , das vom Versuchsorganismus verbraucht wird. CuSO₄ ist giftig für wirbellose Tiere, vermeiden Sie Verschüttungen oder Leckagen und reinigen Sie es sofort.
9. Den gefüllten_O2-Generator an den zweipoligen Stecker am Sensorstecker anschließen.
   HINWEIS: Die Kupferkathode muss mit dem negativen Ausgang des Controllers und die Platinanode mit dem positiven Draht verbunden werden. Umgekehrte Verbindungen führen zum Fehlschlagen des Experiments.
10. Geben Sie zwei kleine Tupfer klares Silikonfett auf gegenüberliegende Seiten der Schlifffuge des Sensorsteckers.
11. Setzen Sie den Stopfen in die Kammer ein und drehen Sie den Stopfen (oder die Kammer) mit mäßigem Druck, um das Fett in der Verbindung zu verteilen.
    1. Überschüssiges Fett mit einem Labortuch abwischen.
12. Schnappen Sie Kunststoff-Keck-Klemmen an Gelenken, um Stopfen in Kammern zu sichern. Die zusammengebaute Kammer sollte wie in Abbildung 1C aussehen.
13. Wiederholen Sie die obigen Schritte für die Anzahl der Kammern, die für das Experiment des Tages verwendet werden.
    HINWEIS: Die Anzahl der Kammern, die aufgezeichnet werden können, ist durch die Anzahl der verfügbaren Kammern, Controller und USB-Eingänge für den Computer begrenzt. Für die vorliegenden Experimente wurden in der Regel sieben Kammern parallel betrieben. Versuchsfliegen wie Mutanten sollten mit geeigneten Kontrollen abgeglichen werden. Eine identisch aufgebaute Kammer, aber ohne Fliegen, sollte in jedes Experiment einbezogen werden, um die Variation der Umwelt zu kontrollieren. Kammern, die verschiedene Behandlungen (Mutante, Wildtyp, Flugverbot) enthalten, sollten zwischen den Experimenten gewechselt werden.
14. Die zusammengebauten Kammern werden bei geöffneten Hähnen in ein Gestell im Wasserbad gestellt (Abbildung 1E).
    HINWEIS: Um zirkadiane Schwankungen zu vermeiden, wurden für alle hier beschriebenen Experimente zwischen 9:30 und 9:50 Uhr Kammern in die Badewanne gestellt.
15. Absperrhähne offen lassen (Halten Sie den Griff parallel zum Absperrhahn).
    HINWEIS: Achten Sie darauf, dass kein Wasser in die Absperrhähne eindringt.
16. Lassen Sie die Kammern mit geöffneten Hähnen ca. 30 Minuten lang ausbalancieren.
    HINWEIS: Während die Kammer im Gleichgewicht ist, schließen Sie die Elektronik an und richten Sie die Datenerfassung wie unten beschrieben ein.

3. Einrichten von Controllern und Computer

1. Vergewissern Sie sich, dass sich die Schalter, die die O_{2-Generatoren} mit Strom versorgen, in der OFF-Position befinden (weg vom Stecker; Abbildung 1D).
2. Schließen Sie jede Controller-Box an einen verfügbaren USB-Anschluss (Universal Serial Bus) an.
   HINWEIS: Aufbau und Programmierung von Steuergeräten, die an anderer Stelle^{beschrieben werden 12}.
3. Verbinden Sie die Controller mit 6-adrigen Kabeln mit den Respirometerkammern.
4. Vergewissern Sie sich, dass auf den OLED-Displays (Organic Light Emitting Diode) der Controller (Abbildung 1D) Umgebungsparameter angezeigt werden.
5. Schalten Sie die Generatoren O₂ kurz mit dem Schalter am Regler ein (Abbildung 1D).
   1. Steigt der Stromwert von Null auf 35 bis 55 mA, sind Regler und Kammer bereit für Experimente.
6. Ermitteln Sie, welche COM-Ports von den Controllern verwendet werden, wie unten beschrieben.
   1. Klicken Sie in Microsoft Windows auf das Startsymbol .
   2. Klicken Sie auf das Symbol Einstellungen .
   3. Klicken Sie auf Bluetooth und Geräte.
   4. Stellen Sie sicher, dass die Controller und ihre COM-Ports in der Liste der Geräte angezeigt werden.
7. Öffnen Sie PuTTY auf dem Desktop und richten Sie eine Protokolldatei für jeden Kanal des Respirometers ein, wie unten beschrieben.
   HINWEIS: PuTTY ist ein kostenloser sicherer Shell- und Telnet-Client, der verwendet wird, um Daten über COM-Ports auf den Computer zu übertragen.
   1. Wählen Sie den COM-Port für einen Controller aus, indem Sie die Nummer des Ports in das Feld "Serielle Leitung" eingeben (Abbildung 2A).
   2. Klicken Sie auf Protokollierung.
   3. Wählen Sie unter "Sitzungsprotokollierung" die Option Druckbare Ausgabe aus (Abbildung 2B).
   4. Klicken Sie unter Protokolldateiname auf Durchsuchen.
   5. Erstellen Sie im gewünschten Ordner einen Dateinamen, der beschreibende Informationen enthält (z. B. Datum, Spezies, COM-Port-Nummer).
   6. Klicken Sie auf Speichern.
   7. Klicken Sie auf Öffnen. Es öffnet sich ein Fenster, in dem durch Kommas getrennte Daten protokolliert werden (Abbildung 2C).
   8. Wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Controller, die für das Experiment verwendet werden. Die Eingabe an jedem COM-Port wird als separates Fenster angezeigt (Abbildung 2D).

4. Durchführen von Experimenten

1. Sobald sich die Kammern 30 Minuten lang ausbalanciert haben, verschließen Sie sie, indem Sie die Hähne schließen.
2. Decken Sie das Bad und die Kammern mit einer Styroporschaumbox ab, um eine stabile Umgebung zu erhalten.
3. Eine weitere Stunde ausgleichen lassen.
4. Schalten Sie den Strom für den_O2-Generator jeder Kammer mit dem Schalter an der Reglerbox ein.
5. Sobald die O_{2-Generatoren} aktiviert sind, stellen Sie sicher, dass der Druck auf den voreingestellten AUS-Druck ansteigt.
   ANMERKUNG: 1017 hPa, was etwas über dem atmosphärischen Druck liegt, wurde in dieser Versuchsreihe als "OFF"-Druck verwendet. Die Rückkehr zum Umgebungsdruck zeigt an, dass Gas aus den Kammern austritt. Darüber hinaus ermöglicht es die Verwendung des gleichen Drucks in allen Experimenten, unabhängig vom barometrischen Umgebungsdruck. Der "ON"-Druck betrug 1016 hPa, was bedeutet, dass der Druck nur um 1 hPa sinken musste, bevor der_O2-Generator aktiviert wurde. Dies lieferte eine ausreichende Sensitivität, um den_O2-Verbrauch in Drosophila zu messen. Sobald eine Kammer unter Druck gesetzt wird, sollte der Strom auf Null fallen.
6. Lassen Sie das Experiment 3 oder mehr Stunden lang laufen.
   HINWEIS: Höhere V_O2 bei erhöhten Temperaturen können kürzere Versuchszeiten ermöglichen. Überwachen Sie gelegentlich, um sicherzustellen, dass die Geräte funktionieren, aber vermeiden Sie übermäßige Aktivitäten in der Nähe der Kammern, die die Temperaturstabilität beeinträchtigen könnten.

5. Beenden des Experiments

1. Schalten Sie die_{O2-Generatoren} an allen Reglern aus.
   HINWEIS: Tun Sie dies zuerst, um zu vermeiden, dass die O_{2-Generatoren} laufen, während die Kammern geöffnet sind.
2. Öffnen Sie die Absperrhähne, um die Kammern zu entsiegeln.
3. Lassen Sie die PuTTY-Fenster für weitere 5-15 Minuten geöffnet, um eine endgültige Ausgangsbasis zu erhalten.
4. Schließen Sie das PuTTY-Fenster für jeden Controller und beenden Sie die Aufzeichnungen.
   HINWEIS: Alle Experimente endeten zwischen 16:50 und 17:10 Uhr.
5. Trennen Sie die Sensoren von den Kabeln.
6. Schieben Sie die Kammern in den Trockenkorb.
7. Entfernen Sie die Sensorstopfen nacheinander aus den Kammern.
8. Trennen Sie die O_{2-Generatoren} und setzen Sie sie in das Röhrchengestell ein.
9. Wischen Sie den Sensorstecker vom Fett ab und bewahren Sie ihn im Gestell auf.
10. Reinigen Sie die Kammergelenke von Fett und entfernen Sie Schläuche mit Fliegen und Kalknatron.
11. Anästhesiefliegen werden in jedem Röhrchen mit CO 2 betäubt_, auf ein Gewichtsboot geklopft und auf einer Mikrowaage gewogen.
    1. Protokollieren Sie das Gewicht und die Anzahl der Fliegen für jede Röhre.
12. Werfen Sie Fliegen weg oder legen Sie sie für weitere Prozeduren beiseite.
13. Kippen Sie Kalknatron-Natron-Kalk aus den Kartuschen in den Abfallbehälter.
14. Öffnen Sie den_O2-Generator und entsorgen Sie die_{CuSO4-Lösung} in den Abfallbehälter.
    1. Spülen Sie Elektroden und Röhrchen mit gereinigtem Wasser.
    2. Platzieren Sie die Röhrchengestelle zum Trocknen.

6. Analyse der Ladungsübertragungsdaten

1. Importieren Sie Daten als durch Kommas getrennten Text in eine Tabelle, wobei jeder Datensatz ein separates Arbeitsblatt enthält.
2. Zeichnen Sie die aktuellen und Zeitdaten für jeden Impuls des_{O2-Generators} auf. Beginnend mit dem ersten Impuls, nachdem die Kammer unter Druck gesetzt wurde, notieren Sie die Start- und Endzeit (als Zeilennummern) jedes Stromimpulses. Das ist die Zeilennummer, wenn der Strom über Null (normalerweise auf etwa 45-50 mA) bis zur letzten Reihe, die über Null liegt, geht.
3. Erstellen Sie eine Tabelle auf dem Arbeitsblatt, um die folgenden Daten aufzuzeichnen:
   1. Die durchschnittliche Stromamplitude während des Impulses: = MITTELWERT([erste Impulszeile]:[letzte Impulszeile]) für jeden Impuls (aus der aktuellen Spalte).
   2. Impulsdauer: ([Letzte Impulszeile] - [erste Impulszeile[-eine Zeile]])/1000 für jeden Impuls (aus der Spalte Zeit in Millisekunden).
   3. Gesamtversuchszeit: [Zeit zu Beginn des letzten Impulses] - [Zeit am Ende des ersten Impulses nach Druckbeaufschlagung der Kammer] (aus der Spalte Zeit in Minuten).
4. Berechnen Sie dann den Ladungstransfer (Q) für jeden Impuls (durchschnittlicher Strom X Dauer)
5. Addieren Sie die Ladung aus allen Impulsen, um die Gesamtladung (Q_tot) zu berechnen.

7. Analyse des_{O2-Verbrauchs}

1. Richten Sie eine neue Tabelle für alle Daten ein und geben Sie für jede Kammer Folgendes ein oder berechnen Sie Folgendes:
   1. Q_tot (Gesamtladung)
   2. Muttermale (= Q ÷ 96485 × 4)
   3. mL_O2 (= Mol × 22413 mL/mol)
   4. Gesamtzeit (aus der obigen Datenanalyse)
   5. mL ^min-1 (= ml_O2 ÷ Gesamtzeit)
   6. Gewicht in Gramm (Fliegen, betäubt und gewogen, gemessen nach dem Experiment)
   7. mL min-1 g-1 (= mL ^min-1 ÷ Gewicht in Gramm)
   8. ml/h/g (die oben genannten × 60)
   9. mg/Fliege (= Gewicht der Fliegen ÷ Anzahl der Fliegen)
   10. μL fly-1 h-1 (= (mL ^min-1 × 3600) ÷ Anzahl der Fliegen).
2. Tabellarische Daten für jede Behandlung (z.B. Genotyp)
3. Vergleichen Sie Behandlungen mit ANOVA, t-Test oder Mann-Whitney u-test ¹³.

Ergebnisse

Die Druck- und Stromausgänge des Respirometer-Controllers sind für eine Kammer in einem Experiment in Abbildung 3A dargestellt. Der erste, lange Stromimpuls beaufschlagte die Kammer vom Umgebungsdruck (ca. 992 hPa) bis zur voreingestellten Ausschaltschwelle von 1017 hPa. Als die Fliegen O 2 verbrauchten und CO₂ absorbiert wurde, sank der Druck langsam, bis er die EIN-Schwelle von 1016 hPa erreichte, wodurch Strom durch den_O2-Generator aktiviert wurde. Im ge...

Diskussion

Das obige Verfahren zeigt die Messung des_{O2-Verbrauchs} in D. Melanogaster mit einem elektronischen coulometrischen Mikrorespirometer. Die resultierenden Daten für den_O2-Verbrauch bei Wildtyp-D. melanogaster lagen innerhalb der Bereiche, die in den meisten früheren Veröffentlichungen mit verschiedenen Methoden beschrieben wurden (Tabelle 1), wenn auch etwas niedriger als die^{von anderen berichteten 3,6}.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers