Screening von Ionenkanälen in Krebszellen

Zusammenfassung

Das pharmakologische Targeting von Ionenkanälen ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung solider Tumore. Es werden detaillierte Protokolle zur Charakterisierung der Ionenkanalfunktion in Krebszellen und zur Untersuchung der Auswirkungen von Ionenkanalmodulatoren auf die Lebensfähigkeit von Krebs bereitgestellt.

Zusammenfassung

Ionenkanäle sind entscheidend für die Zellentwicklung und die Aufrechterhaltung der Zellhomöostase. Die Störung der Ionenkanalfunktion trägt zur Entwicklung eines breiten Spektrums von Erkrankungen oder Kanalopathien bei. Krebszellen nutzen Ionenkanäle, um ihre eigene Entwicklung voranzutreiben, sich als Tumor zu verbessern und sich in einer Mikroumgebung zu assimilieren, die verschiedene nicht-krebsartige Zellen enthält. Darüber hinaus kann ein Anstieg des Spiegels von Wachstumsfaktoren und Hormonen in der Mikroumgebung des Tumors zu einer erhöhten Expression von Ionenkanälen führen, was zur Proliferation und zum Überleben von Krebszellen beiträgt. Daher ist das pharmakologische Targeting von Ionenkanälen potenziell ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung solider Malignome, einschließlich primärer und metastasierender Hirntumoren. In dieser Arbeit werden Protokolle zur Charakterisierung der Funktion von Ionenkanälen in Krebszellen und Ansätze zur Analyse von Modulatoren von Ionenkanälen beschrieben, um ihren Einfluss auf die Lebensfähigkeit von Krebs zu bestimmen. Dazu gehören die Färbung einer Zelle(n) für einen oder mehrere Ionenkanäle, das Testen des polarisierten Zustands von Mitochondrien, die Feststellung der Ionenkanalfunktion mithilfe von Elektrophysiologie und die Durchführung von Viabilitätstests zur Beurteilung der Wirksamkeit von Arzneimitteln.

Einleitung

Membrantransportproteine sind entscheidend für die Kommunikation zwischen Zellen sowie für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Unter den Membrantransportproteinen dienen Ionenkanäle dazu, das Wachstum und die Entwicklung von Zellen voranzutreiben und den Zustand von Zellen in herausfordernden und sich verändernden Umgebungen aufrechtzuerhalten. Es wurde auch berichtet, dass Ionenkanäle die Entwicklung solider Tumore sowohl systemisch als auch im Zentralnervensystem (ZNS) vorantreiben und ^{unterstützen1,2}. Zum Beispiel sind KCa3.1-Kanäle für die Regulierung des Membranpotenzials und die Kontrolle de....

Protokoll

1. Immunmarkierung von Ionenkanälen in kultivierten Zellen

1. Vorbereitung der Zellen und Versuchsaufbau
   1. Halten Sie die Zellen als aktiv wachsende Kultur in 75 cm² Kulturkolben. Passieren Sie die Zellen einmal, bis sie zu 50 % bis 90 % konfluent sind, abhängig von der Verdopplungszeit der verwendeten Zelllinie.
      HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden D283-Zellen, eine Medulloblastom-Zelllinie der Gruppe 3, verwendet.
   2. Die Zellen werden aus dem Kulturkolben in ein Zentrifugenröhrchen (15 ml oder 50 ml) aufgenommen und 2 ml 0,25%iges Trypsin-EDTA zugegeben, um adhärente Zellen abzulösen. 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubier....

Diskussion

Veränderungen in der Ionenkanalfunktion verändern intrazelluläre Signalkaskaden, was sich auf die Gesamtfunktion einer Zelle auswirken kann. In den letzten zehn Jahren wurde immer deutlicher, dass Ionenkanäle für das Wachstum und die Metastasierung von Krebszellen wichtig sind. Wichtig ist, dass viele Ionenkanäle primäre Ziele für zugelassene Therapeutika sind, die auf ein breites Spektrum von Erkrankungen abzielen²⁴. Forscher haben untersucht, ob Ionenkanäle Ziele gegen Krebs sein könnt.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABS SpectraMax Plate Reader	Molecular Devices	ABS
Accutase	Invitrogen	00-4555-56
Alexa Flor 488	Invitrogen	A32723	Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	100x
B27 Supplement	Gibco	12587-010	Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet	LABCONCO	302381101	Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1606-100
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13-998-211	Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C7902	Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm	Fisher Scientific	12-600-004	Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2	Fisher Scientific	430641U	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well	Fisher Scientific	353046	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well	Fisher Scientific	353072	Cell culture treated
Centrifuge	Eppendorf	EP-5804R	Refrigerated
Corning CoolCell	Fisher Scientific	07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-553-450	Corning brand
D283 Med	ATCC	HTB-185
DABCO Mounting Media	EMS	17989-97
D-Glucose	Sigma Life Sciences	D9434
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650	Cell culture grade
DMEM/F12, base media	Fisher Scientific	11330-032	With phenol red
DMEM/F12, phenol red free	Fisher Scientific	21041-025
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Epidermal Growth Factor	STEMCELL	78006.1
FCCP	Abcam	AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic	Millipore	GF003
GARBA5 Antibody	Aviva	ARP30687_P050	Rabbit Polyclonal
Glutamax	Gibco	35050-061
Glycerol Mounting Medium	EMS	17989-60	With DAPI+DABCO
Hemocytometer	Millipore Sigma
Heparin	STEMCELL	7980
HEPES	HyClone	SH3023701	Solution
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	Solid
ImageJ	Open platform		With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI	EMS	17989-97
KRM-II-08			experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X	Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor	Novus	N276314100U
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M9272	Hexahydrate
Microscope, Confocal	Leica	SP8
Microscope, Light	VWR	76382-982	DMiL Inverted
MTS - Promega One Step	Promega	G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL	Eppendorf	Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL	Eppendorf	Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL	Eppendorf	Z683957
Nest-O-Patch	Heka
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888022	Without vitamin A
Neurobasal-A Medium	Gibco	12348-017	Phenol red free
Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140-050
NOR-QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm	Fisher Scientific	50-998-944	4 inch width
Paraformaldehyde	EMS	RT-15710
PATHCHMASTER	Heka
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Perfusion System	Nanion	4000120
PFA	EMS	RT-15710
Phosphate Bufered Saline	Fisher Scientific	AAJ75889K2	Reagent grade
Poly-D-Lysine	Fisher Scientific	A3890401
Poly-L-Lysine	Sigma Life Sciences	P4707
Port-a-Patch	Nanion	21000072
Potassium Chloride	Sigma Life Sciences	P5405
Primary Antibody	Invitrogen	MA5-34653	Rabbit Monoclonal
Prism	GraphPad
Propofol	Fisher Scientific	NC0758676	1 mL ampule
QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs	VWR	89094-664	Sterile
Slides, 75 x 25 mm	Fisher Scientific	12-544-7	Frosted one side
Sodium Bicarbonate	Corning	25-035-Cl
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070
Synth-a-Freeze Medium	Gibco	R00550	Cryopreservation
TMRE	Fisher Scientific	50-196-4741	Reagent
TMRE Kit	Abcam	AB113852	Kit
Triton X-100	Sigma Aldrich	NC0704309
Trypan Blue	Gibco	15-250-061	Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA	Gibco	25200-072	Solution, 0.25%
Vortex Mixer	VWR	97043-562
Whatman Filter Paper	Fisher Scientific	09-927-841