Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Zusammenfassung

Mitochondriale Kontaktstellen sind Proteinkomplexe, die mit mitochondrialen inneren und äußeren Membranproteinen interagieren. Diese Stellen sind essentiell für die Kommunikation zwischen den mitochondrialen Membranen und damit zwischen dem Zytosol und der mitochondrialen Matrix. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung von Kandidaten, die sich für diese spezifische Klasse von Proteinen qualifizieren.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind in praktisch allen eukaryotischen Zellen vorhanden und erfüllen essentielle Funktionen, die weit über die Energiegewinnung hinausgehen, z. B. die Synthese von Eisen-Schwefel-Clustern, Lipiden oder Proteinen, die Ca2⁺ -Pufferung und die Induktion von Apoptose. Ebenso führt eine mitochondriale Dysfunktion zu schweren menschlichen Krankheiten wie Krebs, Diabetes und Neurodegeneration. Um diese Funktionen erfüllen zu können, müssen die Mitochondrien über ihre Hülle, die aus zwei Membranen besteht, mit dem Rest der Zelle kommunizieren. Daher müssen diese beiden Membranen ständig miteinander interagieren. Proteinhaltige Kontaktstellen zwischen der inneren und äußeren Membran der Mitochondrien sind dabei essentiell. Bisher wurden mehrere Kontaktstellen identifiziert. Bei der hier beschriebenen Methode werden die Mitochondrien von Saccharomyces cerevisiae verwendet, um Kontaktstellen zu isolieren und so Kandidaten zu identifizieren, die für Kontaktstellenproteine in Frage kommen. Wir haben diese Methode verwendet, um den mitochondrialen Kontaktstellen- und Cristae-Organisierungssystem-Komplex (MICOS) zu identifizieren, einen der wichtigsten kontaktstellenbildenden Komplexe in der mitochondrialen Innenmembran, der von der Hefe bis zum Menschen konserviert ist. Kürzlich haben wir diese Methode weiter verbessert, um eine neue Kontaktstelle zu identifizieren, die aus Cqd1 und dem Por1-Om14-Komplex besteht.

Einleitung

Mitochondrien erfüllen in Eukaryoten eine Vielzahl unterschiedlicher Funktionen, wobei die bekannteste die Produktion von ATP durch oxidative Phosphorylierung ist. Weitere Funktionen sind die Produktion von Eisen-Schwefel-Clustern, die Lipidsynthese und in höheren Eukaryoten die Ca2⁺-Signalgebung und die Induktion der Apoptose 1,2,3,4. Diese Funktionen sind untrennbar mit ihrer komplexen Ultrastruktur verbunden.

Die mitochondriale Ultrastruktur wurde erstmals mittels Elektronenmikroskopie

Protokoll

1. Puffer und Vorratslösungen

1. Stellen Sie eine 1 M große 3-Morpholinopropan-1-sulfonsäure (MOPS)-Lösung in deionisiertem Wasser mit einem pH-Wert von 7,4 her. Bei 4 °C lagern.
2. Bereiten Sie 500 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in deionisiertem Wasser mit einem pH-Wert von 8,0 vor. Bei Raumtemperatur lagern.
3. Bereiten Sie 2,4 M Sorbit in deionisiertem Wasser vor. Nach dem Autoklavieren bei Raumtemperatur lagern.
4. 2,5 M Saccharose in entionisiertem Wasser zubereiten. Nach dem Autoklavieren bei Raumtemperatur lagern.
5. Bereiten Sie 200 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) in Isopropanol vor. Bei −20 °C ....

Diskussion

Die mitochondriale Subfraktionierung ist ein kompliziertes Experiment mit mehreren hochkomplexen Schritten. Daher haben wir uns zum Ziel gesetzt, unsere etablierte Methode³² weiter zu verbessern und bis zu einem gewissen Grad zu vereinfachen. Die Herausforderungen lagen hier in der Anforderung an komplizierten und hochspezialisierten Geräten, bei denen es sich oft um Einzelkonstruktionen handelt, sowie dem enormen Zeit- und Energieverbrauch. Zu diesem Zweck haben wir versucht, die Pumpen und Einz.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Instruments, Germany	344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm	Beckman Instruments, Germany	363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g	Beckman Instruments, Germany	363055
Abbe refractometer	Zeiss, Germany		discontinued, any pipet controller will suffice
accu-jet pro Pipet Controller	Brandtech, USA	BR26320	discontinued, any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL	DWK Life Science, Germany	C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D	Branson Ultrasonics, USA	FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP	Branson Ultrasonics, USA	101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell	Branson Ultrasonics, USA	15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26	Beckman Instruments, Germany	B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra	Beckman Instruments, Germany	8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail	Roche, Switzerland	11697498001
D-Sorbit	Roth, Germany	6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)	Roth, Germany	8043
Erlenmeyer flask, 100 mL	Roth, Germany	X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1	Hirschmann, Germany	1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05	Hirschmann, Germany	1180153
ice bath	neoLab, Germany	S12651
Magnetic stirrer RCT basic	IKA-Werke GmbH, Germany	Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)	Gerbu, Germany	1081
MyPipetman Select P1000	Gilson, USA	FP10006S
MyPipetman Select P20	Gilson, USA	FP10003S
MyPipetman Select P200	Gilson, USA	FP10005S
Omnifix 1 mL	Braun, Germany	4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Serva, Germany	32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm	Braun, Germany	4022495052414
stirring bar, 15 mm	VWR, USA	442-0366
Sucrose	Merck, Germany	S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Instruments, Germany	331362
Test tubes	Eppendorf, Germany	3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel	VWR, USA	432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip	VWR, USA	432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma Aldrich, Germany	33731	discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS	Roth, Germany	4855