Optimierte automatisierte Analyse der homöostase-Modulation lebender neuronaler Mitochondrien durch isoformspezifische Retinsäurerezeptoren

Zusammenfassung

Das mitochondriale Netzwerk ist extrem komplex, was die Analyse sehr schwierig macht. Ein neuartiges MATLAB-Tool analysiert konfokal abgebildete Mitochondrien in Zeitrafferbildern, führt jedoch zu einem großen Ausgabevolumen, das individuelle manuelle Aufmerksamkeit erfordert. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Routineoptimierung entwickelt, die eine schnelle Dateianalyse ermöglicht.

Zusammenfassung

Das komplexe mitochondriale Netzwerk macht es sehr schwierig, lebende Zellen zu segmentieren, zu verfolgen und zu analysieren. MATLAB-Tools ermöglichen die Analyse von Mitochondrien in Zeitrafferdateien und vereinfachen und beschleunigen den Prozess der Bildverarbeitung erheblich. Nichtsdestotrotz produzieren bestehende Werkzeuge ein großes Ausgabevolumen, das individuelle manuelle Aufmerksamkeit erfordert, und einfache Versuchsaufbauten haben eine Ausgabe von Tausenden von Dateien, die jeweils eine umfangreiche und zeitaufwändige Handhabung erfordern.

Um diese Probleme zu lösen, wurde eine routinemäßige Optimierung entwickelt, sowohl in MATLAB-Code- als auch in Live-Skript-Form, die eine schnelle Dateianalyse ermöglicht und das Lesen und die Datenverarbeitung von Dokumenten erheblich reduziert. Mit einer Geschwindigkeit von 100 Dateien/min ermöglicht die Optimierung eine insgesamt schnelle Analyse. Die Optimierung erzielt die Ergebnisse durch die Mittelung rahmenspezifischer Daten für einzelne Mitochondrien über Zeiträume hinweg und analysiert die Daten auf definierte Weise, die mit den Ergebnissen bestehender Tools übereinstimmt. Die konfokale Live-Bildgebung wurde mit dem Farbstoff Tetramethylrhodaminmethylester durchgeführt, und die Routineoptimierung wurde durch die Behandlung neuronaler Zellen mit Retinsäurerezeptor (RAR)-Agonisten validiert, deren Auswirkungen auf neuronale Mitochondrien in der Literatur nachgewiesen sind. Die Ergebnisse stimmten mit der Literatur überein und ermöglichten eine weitere Charakterisierung des mitochondrialen Netzwerkverhaltens als Reaktion auf die isoformspezifische RAR-Modulation.

Diese neue Methodik ermöglichte eine schnelle und validierte Charakterisierung des Mitochondriennetzwerks von Ganzneuronen, aber auch die Unterscheidung zwischen Axon- und Zellkörpermitochondrien, ein wesentliches Merkmal für die Anwendung im neurowissenschaftlichen Bereich. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf Experimente mit schnell wirkenden Behandlungen angewendet werden, die die Bildgebung derselben Zellen vor und nach Behandlungen ermöglichen und über das Gebiet der Neurowissenschaften hinausgehen.

Einleitung

Zelluläre Mitochondrien befinden sich im Zentrum aller physiologischen Zustände, und ein gründliches Verständnis ihrer Homöostase (Mitostase) und ihres Verhaltens ist von größter Bedeutung, um eine pharmakologische Behandlung für eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs und Alzheimer, zu identifizieren ^1,2.

Mitochondrien spielen eine entscheidende zelluläre Rolle bei der Energiehomöostase, der ATP-Erzeugung, der Kalziumpufferung und der ROS-Regulation, und die Mitostase ist für die Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase unerlässlich, da molekulare Chaperone energieabhäng....

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll besteht aus zwei Hauptschritten: einem Nasslaborschritt, der Zellkultur und konfokale Lebendmikroskopie umfasst, um Bilder von lebenden Mitochondrien zu erhalten (Abbildung 1), und einem In-silico-Schritt zur Analyse der erhaltenen Bilder (Abbildung 2). Für die automatisierte Datenanalyse von 3D-Live-Mitochondrien wurde die MATLAB-Anwendung Mitometer verwendet, wie sie von Lefebvre et ^al.9 bereitgestellt wurde. Die Routineoptimierung ist in MATLAB geschrieben. Die Software, aktualisierte Versionen und die Verarbeitung von ImageJ-Makros sind online übe....

Diskussion

Die Bildgebung lebender Zellen erzeugt große Dateien, die eine ernsthafte Computerverarbeitung erfordern, aber selbst die neuesten Tools erfordern umfangreiche manuelle Eingaben zur Verarbeitung. Diese Routineoptimierung konzentriert sich auf die Vereinfachung des Prozesses der Mitochondrienanalyse auf dem Mitometer, da dieses Tool ein sehr gutes Gleichgewicht zwischen Benutzereingabe und Datenausgabe bietet. Ein umfassender Vergleich zwischen verschiedenen Werkzeugen für die Mitochondrien-Bildanalyse wurde zuvor über.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AM580	Sigma-Aldrich	A8843
BDNF	Thermo-Fisher	RP8642
BMS493	Tocris Bioscience	3409
CD2314	Tocris Bioscience	3824
Ch55	Tocris Bioscience	2020
Foetal Bovine Serum	Thermo-Fisher	10270106
GraphPad Prism v4.0	GraphPad Software, La Jolla	n/a
Ham’s F12 Nutrient Mix	Thermo-Fisher	21765029
MATLAB R2022a	MathWorks	n/a
Minimal Essential Medium	Thermo-Fisher	31095
Nunc Glass Bottom Dishes	Thermo-Fisher	150680
Phosphate Buffer Saline Solution	Thermo-Fisher	28372
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
TMRM	Thermo-Fisher	T668
Zeiss LSM 510	Carl Zeiss	n/a	Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective