Erzeugung von Zentromer-assoziierten Protein-E CENP-E-/- Knockout-Zelllinien mit dem CRISPR/Cas9-System

Zusammenfassung

Dieser Artikel berichtet über die Konstruktion von Zentromer-assoziierten Protein-E (CENP-E) Knockout-Zellen unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems und drei phänotypbasierter Screening-Strategien. Wir haben die CENP-E-Knockout-Zelllinie verwendet, um einen neuartigen Ansatz zur Validierung der Spezifität und Toxizität der CENP-E-Inhibitoren zu etablieren, der für die Arzneimittelentwicklung und die biologische Forschung nützlich ist.

Zusammenfassung

Das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9-System hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug für die präzise und effiziente Genbearbeitung in einer Vielzahl von Organismen entwickelt. Das Zentromer-assoziierte Protein-E (CENP-E) ist ein Plus-End-gerichtetes Kinesin, das für die Kinetochor-Mikrotubuli-Erfassung, die Chromosomenausrichtung und den Kontrollpunkt der Spindelassemblierung benötigt wird. Obwohl die zellulären Funktionen der CENP-E-Proteine gut untersucht wurden, war es schwierig, die direkten Funktionen von CENP-E-Proteinen mit herkömmlichen Protokollen zu untersuchen, da die CENP-E-Ablation in der Regel zur Aktivierung des Checkpoints der Spindelassemblierung, zum Zellzyklusarrest und zum Zelltod führt. In dieser Studie haben wir das CENP-E-Gen in humanen HeLa-Zellen vollständig ausgeschaltet und die CENP-E^{-/- HeLa-Zellen} mit dem CRISPR/Cas9-System erfolgreich erzeugt.

Es wurden drei optimierte phänotypbasierte Screening-Strategien etabliert, darunter Zellkolonie-Screening, Chromosomenausrichtungsphänotypen und die Fluoreszenzintensitäten von CENP-E-Proteinen, die die Screening-Effizienz und die experimentelle Erfolgsrate der CENP-E-Knockout-Zellen effektiv verbessern. Wichtig ist, dass die CENP-E-Deletion zu einer Chromosomenfehlstellung, der abnormalen Position der BUB1-mitotischen Checkpoint-Serin/Threonin-Kinase-B-Proteine (BubR1) und mitotischen Defekten führt. Darüber hinaus haben wir das CENP-E-Knockout-HeLa-Zellmodell verwendet, um eine Identifizierungsmethode für CENP-E-spezifische Inhibitoren zu entwickeln.

In dieser Studie wurde ein nützlicher Ansatz zur Validierung der Spezifität und Toxizität von CENP-E-Inhibitoren etabliert. Darüber hinaus werden in diesem Artikel die Protokolle der CENP-E-Geneditierung mit dem CRISPR/Cas9-System vorgestellt, das ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Mechanismen von CENP-E bei der Zellteilung sein könnte. Darüber hinaus würde die CENP-E-Knockout-Zelllinie zur Entdeckung und Validierung von CENP-E-Inhibitoren beitragen, die wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von Antitumormedikamenten, die Untersuchung von Zellteilungsmechanismen in der Zellbiologie und klinische Anwendungen haben.

Einleitung

Engineered Genome Editing vermittelt die gezielte Modifikation von Genen in einer Vielzahl von Zellen und Organismen. In Eukaryoten kann die ortsspezifische Mutagenese durch die Anwendung sequenzspezifischer Nukleasen eingeführt werden, die die homologe Rekombination der Ziel-DNA^{stimulieren 1}. In den letzten Jahren wurden mehrere Genom-Editing-Technologien, darunter Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs)^2,3, Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALENs)^4,5 und Homing-Meganukleasen ^6,7

Protokoll

1. Aufbau der CRISPR/Cas9-Gen-Knockout-Vektoren

1. Wählen Sie die genomische Ziel-DNA-Sequenz auf dem humanen CENP-E-Gen (GenBank Accession No. NM_001286734.2) und entwerfen Sie die sgRNA mit einem Online-CRISPR-Design-Tool (http://crispor.tefor.net/).
2. Geben Sie eine einzelne genomische Sequenz ein, wählen Sie das Genom von "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148" und wählen Sie das Protospacer-benachbarte Motiv "20 bp-NGG-spCas9" aus. Wählen Sie zwei Leitsequenzen, einschließlich sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' und sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3....

Diskussion

Kinesin-7 CENP-E ist ein wichtiger Regulator bei der Chromosomenausrichtung und dem Kontrollpunkt der Spindelassemblierung während der Zellteilung 17,19,20. Die genetische Deletion von CENP-E führt in der Regel zur Aktivierung des Spindelmontage-Checkpoints, zum Zellzyklusarrest und zum Zelltod 27,29,51,52.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
24-well plate	Corning	3524
4S Gelred, 10,000x in water	Sangon Biotech (Shanghai)	A616697
50 mL centrifuge tube	Corning	430828
6 cm Petri dish	Corning	430166
95% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	10009164
96-well plate	Corning	3599
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent	10000218	Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0428	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Beyotime	A0423	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0460	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab254326	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376392	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab133583	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium	Beyotime	P0131	Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody	Abcam	ab7291	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer	Biotek Instruments	Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sinopharm Chemical Reagent	69003435
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay	Promega	G3580
Centrifuge	Eppendorf	5424BK745380
Colchicine	Sinopharm Chemical Reagent	61001563
Confocal scanning microscope	Leica	Leica TCS SP8
Coverslip	CITOTEST	80344-1220
DAPI	Beyotime	C1006
DH5α competent cells	Sangon Biotech (Shanghai)	B528413
DL2000 DNA marker	TaKaRa	3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit	Omega	D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518251
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biotechnology	11011-8611
Gentian violet	Sinopharm Chemical Reagent	71019944	Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution	Sinopharm Chemical Reagent	71020260
GraphPad Prism version 8.0 software	GraphPad	www.graphpad.com	Statistical analysis.
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
Humidified incubator	Heal Force	HF90/HF240
Image J software	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	Image processing and analysis.
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics	XD-202
LB agar powder	Sangon Biotech (Shanghai)	A507003
Lipo6000 transfection reagent	Beyotime	C0526
Nikon Ti-S2 microscope	Nikon	Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution	HyClone	SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518191
T4 DNA ligase	TaKaRa	2011A
T4 polynucleotide kinase	TaKaRa	2021A
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent	30188928	Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent	30189328	Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.