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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In dieser Studie haben wir eine kostengünstige oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS)-basierte Fingerabdruck-Nanosonde mit günstiger Biokompatibilität entwickelt, um markierungsfreies Lebendzell-Bioimaging zu zeigen und zwei Bakterienstämme zu detektieren, wobei im Detail gezeigt wird, wie man SERS-Spektren von lebenden Zellen mit einer zerstörungsfreien Methode erhält.

Zusammenfassung

Die Technologie der oberflächenverstärkten Raman-Streuung (SERS) hat im biomedizinischen Bereich aufgrund ihrer Fähigkeit, molekulare Fingerabdruckinformationen biologischer Proben zu liefern, sowie ihres Potenzials in der Einzelzellanalyse immer mehr Aufmerksamkeit erregt. Ziel dieser Arbeit ist es, eine einfache Strategie für die markierungsfreie SERS-Bioanalyse auf Basis von Au@carbon-Punkt-Nanosonden (Au@CDs) zu entwickeln. Hier werden aus Polyphenolen gewonnene CDs als Reduktionsmittel verwendet, um Kern-Schale- Au@CD Nanostrukturen schnell zu synthetisieren, was aufgrund des kooperativen Raman-Verstärkungsmechanismus eine leistungsstarke SERS-Leistung ermöglicht, selbst wenn die Konzentration von Methylenblau (MB) nur 10-9 M beträgt. Für die Bioanalytik kann Au@CDs als einzigartiger SERS-Nanosensor dienen, um die zellulären Bestandteile von Bioproben (z. B. Krebszellen und Bakterien) zu identifizieren. Die molekularen Fingerabdrücke verschiedener Spezies können nach Kombination mit der Hauptkomponentenanalyse weiter unterschieden werden. Darüber hinaus ermöglichen Au@CDs auch eine markierungsfreie SERS-Bildgebung zur Analyse intrazellulärer Zusammensetzungsprofile. Diese Strategie bietet eine praktikable, markierungsfreie SERS-Bioanalyse und eröffnet damit eine neue Perspektive für die Nanodiagnostik.

Einleitung

Die Einzelzellanalyse ist unerlässlich, um die zelluläre Heterogenität aufzudecken und den Gesamtzustand der Zelle zu beurteilen. Die unmittelbare Reaktion der Zelle auf die Mikroumgebung rechtfertigt ebenfalls eine Einzelzellanalyse1. Es gibt jedoch einige Einschränkungen bei den aktuellen Techniken. Die Fluoreszenzdetektion kann auf die Einzelzellanalyse angewendet werden, ist jedoch durch die geringe Empfindlichkeit eingeschränkt. Weitere Herausforderungen ergeben sich aus dem komplizierten Fluoreszenzhintergrund der Zellen und der Fluoreszenz-Photobleichung unter Langzeitbestrahlung2. Die oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) kann sich aufgrund ihrer Vorteile in Bezug auf die Einzelzellanalyse qualifizieren, einschließlich (1) der Reflexion der intrinsischen molekularen Fingerabdruckinformation und der momentanen Situation, (2) der ultrahohen Oberflächenempfindlichkeit, (3) der bequemen Multiplex-Detektion, (4) der hohen Photostabilität, (5) der Detektion kann für eine vergleichende Analyse quantifiziert werden, (6) der Vermeidung zellulärer Autofluoreszenz mit der NIR-Wellenlängenanregung, (7) der Nachweis kann in einem zellulären wässrigen und (8) kann die Detektion auf einen bestimmten Bereich innerhalb der Zelle 3,4,5 gerichtet werden.

Es gibt zwei allgemein anerkannte Mechanismen, um SERS als grundlegendes Phänomen zu verstehen: elektromagnetische Verstärkung (EM) als dominante Ursache und chemische Verstärkung (CM). EM bezieht sich auf die Schwingung kollektiver Elektronen, die von elektromagnetischen Wellen angetrieben wird, wenn die Frequenz des einfallenden Lichts mit der Frequenz der freien Elektronen übereinstimmt, die im Metall oszillieren, was zu einer Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) führt. Wenn lokalisierte SPR (LSPR) durch den auftreffenden Laser auf die Metallnanopartikel (NPs) auftritt, führt dies zur resonanten Absorption oder Streuung des einfallenden Lichts. Folglich kann die elektromagnetische Feldintensität von Metall-NPs um zwei bis fünf Ordnungenerhöht werden 4. Der Schlüssel zur enormen Verbesserung des SERS ist jedoch nicht ein einzelner metallischer NP, sondern die Lücke zwischen zwei NPs, die Hot Spots erzeugt. CM wird von zwei Seiten erzeugt, darunter (1) Wechselwirkungen zwischen Zielmolekülen und Metall-NPs und (2) Zielmoleküle, die in der Lage sind, Elektronen zu/von Metall-NPs zu übertragen 4,5. Ausführlichere Details finden Sie in diesen Übersichtsartikeln 4,5. In der bisherigen Literatur wurden mehrere vielversprechende Methoden für die SERS-Biosensorik und -Bildgebung in lebenden Zellen vorgestellt, z. B. der Nachweis von apoptotischen Zellen6, Proteinen in Organellen7, intrazellulären miRNAs8, zellulären Lipidmembranen, 9Zytokinen10 und Metaboliten11 in lebenden Zellen sowie die Identifizierung und Überwachung von Zellen durch konfokale SERS-Bildgebung2, 11,12,13. Interessanterweise bietet das markierungsfreie SERS den einzigartigen Vorteil von SERS, das interne molekulare Spektren beschreiben kann5.

Ein wichtiges Thema für markierungsfreie SERS ist ein rationelles und zuverlässiges Substrat. Typische SERS-Substrate sind Edelmetall-NPs, da sie eine hervorragende Fähigkeit haben, viel Licht zu streuen14. Heutzutage wird Nanokompositen aufgrund ihrer bemerkenswerten physikalischen und chemischen Eigenschaften und Biokompatibilität immer mehr Aufmerksamkeit geschenkt. Noch wichtiger ist, dass Nanokomposite aufgrund der intensiven elektromagnetischen Strahlung, die durch die Hot Spots auf den Nanohybriden induziert wird, und der zusätzlichen chemischen Verstärkung, die von anderen nichtmetallischen Materialien ausgeht, eine bessere SERS-Aktivität aufweisen können15. Zum Beispiel verwendeten Feietal. MoS 2-Quantenpunkte (QDs) als Reduzierstücke, um Au-NP@MoS 2-QD-Nanokomposite für die markierungsfreie Nahinfrarot-SERS-Bildgebung von 4T1-Brustkrebszellen (4T1-Zellen) der Maus zu synthetisieren16. Außerdem stellten Li et al. ein 2D-SERS-Substrat her, das aus Au-NPs und 2D-Hafnium-Ditellurid-Nanoblättern besteht, für markierungsfreie SERS-Messungen von lebensmittelbedingten pathogenen Bakterien17. In jüngster Zeit wurden Kohlenstoffpunkte (CDs), gute Elektronendonatoren, als Reduktionsmittel ohne andere Reduktionsmittel oder Bestrahlung verwendet, um Au@carbon-Punkt-Nanosonden (Au@CDs)18 zu synthetisieren, von denen berichtet wurde, dass sie effiziente Materialien sind, um die SERS-Aktivität auf der Grundlage des Ladungstransfereffekts (CT) zwischen Au-Kernen und CD-Hüllen zu verbessern19,20. Darüber hinaus werden CDs als Kappenmittel und Stabilisator erkannt, um zu verhindern, dass Au-NPs21 aggregieren. Darüber hinaus eröffnet es mehr Möglichkeiten für Reaktionen mit Analyten, da es eine große Anzahl von Bindungs- und aktiven Zentren bereitstellen kann20. Jin et al. nutzten die oben genannten Punkte und entwickelten eine schnelle und kontrollierbare Methode zur Herstellung Ag@CD NPs mit einzigartigen SERS-Eigenschaften und hervorragenden katalytischen Aktivitäten zur Überwachung heterogener katalytischer Reaktionen in Echtzeit18.

In dieser Arbeit wurde eine einfache und kostengünstige Methode zur Herstellung von Kern-Schale- Au@CD SERS-Substraten zur Identifizierung zellulärer Komponenten und markierungsfreiem SERS-Lebendzell-Bioimaging sowie zum Nachweis und zur Differenzierung von Escherichia coli (E. coli) und Staphylococcus aureus (S. aureus) demonstriert, die vielversprechend für die Frühdiagnose von Krankheiten und ein besseres Verständnis zellulärer Prozesse ist.

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Protokoll

1. Herstellung von Au@CDs

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt ein Herstellungsverfahren für Au@CDs.

  1. Herstellung der CD-Lösung unter Verwendung von Zitronensäure (CA) und Gallussäure (GA) durch ein typisches hydrothermales Behandlungsverfahren18. 100 μl 3,0 mg ml-1 der hergestellten CD-Lösung werden in 200 μl 10 mM Chlorsäure (HAuCl4) (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur 10 s lang zugegeben, bis eine violette Suspension entsteht.
  2. Zentrifugieren Sie die violette Suspension bei 4.000 × g für 10 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette, wenn die Entfernung der Au@CD Kolloide schwierig ist.
  3. Resuspendieren Sie den Au@CDs mit 200 μl deionisiertem Wasser (spezifischer Widerstand von 18,2 MΩcm), um die überschüssigen CDs zu waschen.
  4. Wiederholen Sie Schritt 1.2 und erhalten Sie die Kern-Schale-NPs, die in 100 μl deionisiertem Wasser redispergiert und bei 4 °C gelagert werden. Die NPs können 1 Monat lang aufbewahrt werden.

2. Charakterisierung von Au@CDs

  1. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
    1. Lassen Sie die CD und Au@CD Proben über Nacht bei -80 °C aus einer gefrorenen Lösung lyophilisieren und zerkleinern Sie sie nach der Gefriertrocknung zu Pulver.
    2. Dispergieren Sie die erhaltenen Pulverproben durch Beschallung bei 100 % Leistung 5 Minuten lang angemessen in das deionisierte Wasser.
    3. Geben Sie ein paar Tropfen der Probensuspension auf ein Cu-beschichtetes TEM-Gitter, das mit einer Spitzenkohlenstofffolie bedeckt ist, und nehmen Sie nach dem Trocknen Bilder mit einem Transmissionselektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV auf (siehe Materialtabelle).
  2. Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR)
    1. Wiederholen Sie Schritt 2.1.1, um Power-Proben zu erhalten, mahlen Sie einige vorgetrocknete KBr-Partikel in einem Mörser zu Pulvern, fügen Sie eine Prise der Probe hinzu und mischen Sie sie gleichzeitig mit den KBr-Pulvern für die IR-Charakterisierung16.
  3. Absorptionsspektroskopie im ultravioletten sichtbaren und nahen Infrarot (UV-vis-NIR)
    1. Bereiten Sie die Suspension von CDs und Au@CDs mit der richtigen Konzentration vor, um sicherzustellen, dass die Absorption kleiner als eins ist, und führen Sie eine UV-vis-NIR-Charakterisierung durch16.
  4. Raman-Spektren
    1. Schalten Sie den 785-nm-Halbleiterlaser mit einer Laserleistung von 10 mW und einer 20-fachen Vergrößerung ein. Stellen Sie die Belichtungsdauer auf 5 s und die Akkumulationszahl auf drei ein.
    2. Ein gleiches Volumen der vorbereiteten Au@CDs Proben wird in 5 μl Methylenblau (MB)-Lösung gegeben und gründlich vermischt.
    3. Geben Sie einen Tropfen Suspension auf das Messingsubstrat, um die SERS-Spektren zu sammeln.

3. Zellkultur

  1. Humane epitheliale Lungenkarzinomzellen (A549-Zellen, im Labor durchgelassen) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin, kultivieren und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren.
  2. Die Zellen werden in 96-Well-Platten (1 × 105 Zellen/Well) ausgesät und mit Au@CDs in verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 20-100 μM behandelt. Verwenden Sie ein CCK-8-Assay-Kit, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen (siehe Materialtabelle). Bei jeder Behandlung werden drei unabhängige Duplikate verwendet.
  3. Um die SERS-Experimente durchzuführen, gehen Sie wie folgt vor:
    1. Geben Sie einen sterilen Saphir-Chip (siehe Materialtabelle) in die 12-Well-Platten und säen Sie dann die Zellen mit 1 ml Medium in eine einzelne Well. Inkubieren Sie die Platten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2über Nacht, um eine Konfluenz von 70 % bis 80 % zu erreichen.
    2. Das Au@CDs in die Vertiefung geben und 4-6 h inkubieren.
      HINWEIS: Testen Sie vor der Inkubation die Stabilität von Substraten, insbesondere von NPs in der Lösungsphase. Diese Materialien sind anfällig für den Abbau durch Auflösungs-, Aggregations- und Sedimentationsprozesse während der Lagerung und Verwendung, was die EM-Verluste verringern und die SERS-Aktivität verringern kann. Noch wichtiger ist, dass die zelluläre Aufnahme weitgehend von der Größe der NPsbeeinflusst werden könnte 22.
    3. Während der Inkubation gelangen Substrate durch endozytäre Aufnahme in die Zellen. Nach der Inkubation werden die Zellen unter einem Lichtmikroskop beobachtet, bis einige schwarze Partikel im Inneren der Zellen zu sehen sind.
      HINWEIS: Wenn die SERS-Intensität schwach ist, versuchen Sie, die Au@CD Konzentration zu erhöhen oder die Inkubationszeit zu verlängern.
    4. Entfernen Sie das Medium, spülen Sie die Saphirchips vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab und tauchen Sie sie für die SERS-Detektion in PBS16.

4. Zell-SERS-Experimente

  1. Öffnen Sie den Computer, schalten Sie das Raman-Spektrometer ein, starten Sie die Software und schalten Sie dann den 785-nm-Laser ein (siehe Materialtabelle).
  2. Klicken Sie auf Neue Messung und starten Sie eine neue spektrale Aufnahme. Kalibrieren Sie17 mit Siliziumwafern vor der Probenmessung.
  3. Nehmen Sie ein 20-faches Objektiv, um sicherzustellen, dass ein klares Zellbild beobachtet wird, und wechseln Sie dann das Objektiv auf 50x. Stellen Sie die Laserleistung von niedrig bis hoch und die entsprechende Belichtungszeit und Akkumulation ein.
    HINWEIS: Überprüfen Sie vor der SERS-Messung die geeignete Laserleistung, um irreversible Zellschäden zu vermeiden und sicherzustellen, dass die Erfassungsparameter konsistent sind. Die SERS-Intensität hängt mit der Laserleistung, der Spotgröße, der Akkumulation und der Belichtungszeit zusammen.
  4. Wählen Sie einen Punkt der zu messenden Zellen aus und klicken Sie auf Ausführen. Jede Zelle wird mit 20 Punkten gemessen, und 10 Zellen werden gemessen, um den Durchschnitt zu ermitteln.
    HINWEIS: Intrazelluläre Komponenten sind kompliziert, was zu großen Spektrenunterschieden führt. Nehmen Sie daher Spektren in ähnlichen Zellregionen auf und nehmen Sie so viele Spektren wie möglich.
  5. Speichern Sie die Spektren.
  6. Klicken Sie auf Neue Streamline-Bildaufnahme, dann auf Videoüberprüfung, wählen Sie den zu fotografierenden Bereich aus und klicken Sie auf OK. Stellen Sie die Parameter ein: 785 nm Kantenstromlinie, Mittelpunkt von 1.200 cm-1, Belichtungsdauer von 5 s, Akkumulationszahl von drei und Laserleistung auf 50 %.
  7. Klicken Sie auf New of Living imaging, wählen Sie Signal to Baseline, stellen Sie den Bereich von der ersten Grenze 625 bis zur zweiten Grenze 1.700 ein und klicken Sie dann auf Bereichseinrichtung. Legen Sie dann die richtigen Schritte fest und klicken Sie auf Übernehmen und OK. Klicken Sie abschließend auf Ausführen , um mit der Durchführung der SERS-Bildgebung zu beginnen.

5. Bakterienkultur- und SERS-Messungen

  1. Verdünnen Sie über Nacht Kulturen von E. coli und S. aureus (1:100) in 5 ml des neuen Luria-Bertani-Mediums (LB) (siehe Materialtabelle). Nach dem Wachstum bei 37 °C auf A600 0,4 bis 0,6 zentrifugiert man die Kultur bei 5.000 × g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren.
  2. Resuspendieren Sie die Pellets in 1 ml PBS, gefolgt von einer 5-minütigen Zentrifugation mit 5.000 × g (bei Raumtemperatur).
  3. Mischen Sie die Bakterienkultur mit dem Au@CDs und beobachten Sie die Mischung direkt unter der SERS-Plattform.

6. Datenanalyse

  1. Glätten Sie die Spektren und korrigieren Sie die Basislinie.
  2. Führen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (PCA)16 mit den verarbeiteten Daten durch.

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Ergebnisse

Die Herstellung der Au@CDs ist in Abbildung 1 dargestellt. Die CDs wurden aus CA und GA über einen typischen hydrothermalen Prozess18 hergestellt. Au@CDs wurden schnell synthetisiert, indem HAuCl4 durch CDs in wässrigen Medien bei Raumtemperatur reduziert wurde. Die Größe und Morphologie von CDs und Au@CDs kann mit TEM und hochauflösendem (HR)TEM23 beobachtet werden. Die hergestellten CDs sind monodispe...

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Diskussion

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Au@CDs mit einer ultradünnen CD-Hülle von 2,1 nm erfolgreich hergestellt wurden. Die Nanokomposite zeigen eine überlegene SERS-Empfindlichkeit als reine Au-NPs. Außerdem verfügen Au@CDs über eine hervorragende Leistung in Bezug auf Reproduzierbarkeit und Langzeitstabilität. Weitere Forschungsarbeiten umfassen die Verwendung von Au@CDs als Substrate zur Durchführung von SERS-Bildgebung von A549-Zellen31 und zum Nachweis von zwei Bakterienstämmen

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32071399 und 62175071), dem Science and Technology Program of Guangzhou (2019050001), der Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2021A1515011988) und der Open Foundation of the Key Laboratory of Optoelectronic Science and Technology for Medicine (Fujian Normal University), Bildungsministerium, China (JYG2009) unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBS buffer (Cell culture)Langeco TechnologyBL316A
6 well cell culture plateLABSELECT11110
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)GLPBIOGK10001
Citric acidShanghai Aladdin Biochemical TechnologyC108869
CO2 incubatorThermo Fisher Technologies3111
Constant temperature magnetic agitatorSartorius Scientific InstrumentsSQP
Cryogenic high speed centrifugeShanghai BoxunSW-CJ-2FD
DMEM high glucose cell culture mediumProcellPM150210
Electronic balanceSartorius Scientific InstrumentsSQP
Enzyme markerThermo Fisher Technologies3111
Fetal bovine serumZhejiang Tianhang Biological Technology11011-8611
Figure 1Figdraw.
Fourier infrared spectrometerThermo, AmericaNicolet 380
Freeze dryerTecanInfinite F50
Gallic acidShanghai Aladdin Biochemical TechnologyG104228
Handheld Raman spectrometerOCEANHOOD, Shanghai, ChinaUspectral-PLUS
HAuCl4Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou)
High resolution transmission electron microscopeThermo Fisher TechnologiesFEI Tecnai G2 Spirit T12
High temperature autoclaveShanghai BoxunYXQ-LS-50S figure-materials-1875
Inverted microscopeNanjing Jiangnan Yongxin OpticalXD-202
LB Broth BRHuankai picoorganism028320
Medical ultra-low temperature refrigeratorThermo Fisher TechnologiesULTS1368
Methylene blueSigma-Aldrich
Pancreatin Cell Digestive SolutionbeyotimeC0207
Penicillin streptomycin double resistanceShanghai BoxunYXQ-LS-50S figure-materials-2549
Pure water meterMillipore, USAMilli-Q System
Raman spectrometerRenishaw
Sapphire chipbeyotime
Thermostatic water bathChangzhou Noki
Ultra-clean tableShanghai BoxunSW-CJ-2FD
Uv-visible light absorption spectrometerMADAPA, ChinaUV-6100S
Wire 3.4Renishaw

Referenzen

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