Schnelle In-vitro-Zytotoxizitätsbewertung des Jurkat-exprimierenden chimären Antigenrezeptors mittels Fluoreszenzbildgebung

Zusammenfassung

Ein Protokoll zur Bewertung der quantitativen Abtötung von Tumorzellen durch Jurkat-Zellen, die chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren, der auf ein einzelnes Tumorantigen abzielt. Dieses Protokoll kann als Screening-Plattform für die schnelle Optimierung von CAR-Scharnierkonstrukten vor der Bestätigung in aus dem peripheren Blut gewonnenen T-Zellen verwendet werden.

Zusammenfassung

Chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen stehen an der Spitze der Onkologie. Ein CAR besteht aus einer Zieldomäne (in der Regel ein einzelnes kettenvariables Fragment, scFv) mit einem begleitenden Intra-Ketten-Linker, gefolgt von einem Scharnier, einer Transmembran und einer kostimulatorischen Domäne. Die Modifikation des Intra-Chain-Linkers und der Scharnierdomäne kann einen signifikanten Einfluss auf die CAR-vermittelte Tötung haben. In Anbetracht der vielen verschiedenen Optionen für jeden Teil eines CAR-Konstrukts gibt es eine große Anzahl von Permutationen. Die Herstellung von CAR-T-Zellen ist ein zeitaufwändiger und teurer Prozess, und die Herstellung und das Testen vieler Konstrukte ist eine hohe Zeit- und Materialinvestition. Dieses Protokoll beschreibt eine Plattform zur schnellen Evaluierung scharnieroptimierter CAR-Konstrukte in Jurkat-Zellen (CAR-J). Jurkat-Zellen sind eine immortalisierte T-Zelllinie mit hoher Lentivirus-Aufnahme, die eine effiziente CAR-Transduktion ermöglicht. Hier stellen wir eine Plattform zur schnellen Evaluierung von CAR-J mit einem Fluoreszenz-Imager vor, gefolgt von der Bestätigung der Zytolyse in PBMC-abgeleiteten T-Zellen.

Einleitung

Die CAR-T-Zelltherapie hat sich bei hämatologischen Malignomen als vielversprechend erwiesen, wie die 6 von der FDA zugelassenen CAR-T-Produkte seit 2017 zeigen, wie das National Cancer Institute^{berichtet 1}. Es gibt zahlreiche CAR-T-Zellen in klinischen Studien zur Bekämpfung solider Tumore. Die Entwicklung neuartiger CAR-Targets und die Optimierung des CAR-Konstrukts sind entscheidend für die Wirksamkeit einer CAR-T-Zelle. Die Wahl des idealen CAR-Konstrukts für jede Anwendung ist entscheidend für ein genaues Targeting von tumorassoziierten Antigenen (TAA) bei gleichzeitiger Vermeidung einer niedrigen TAA-Expression in normalem Gewebe

Protokoll

HINWEIS: Alle Zellkulturarbeiten werden in einer Biosicherheitswerkbank mit Laborkittel, Handschuhen und unter Einhaltung der aseptischen Standardtechniken durchgeführt.

1. Generierung von CAR, das Jurkats (CAR-J) exprimiert

1. Kaufen Sie Jurkat-Zellen, Klon E6-1 von ATCC. 1 x 10⁶ Zellen in einem T-75-Kolben auftauen und in T-75-Kolben kultivieren. Halten Sie sie in Suspension bei 0,6 x 10⁶ Zellen pro ml unter Verwendung von Medien des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), die mit 10 % FBS angereichert sind, in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂.
2. Platte 1 x 10⁵

Diskussion

Hier haben wir eine schnelle Methode vorgeschlagen, um die zielspezifische zytolytische Aktivität, die durch die CAR-Expression in Jurkat-Zellen induziert wird, effizient zu bewerten. Alle CAR-Konstrukte haben das gleiche scFv, aber unterschiedliche Scharnier- und Transmembrandomänen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Potenz von CAR-T-Zellen beeinflussen¹³. Eine weitere Evaluierung der unspezifischen Abtötung durch diese CAR-J erfolgte durch Kultivierung mit Antigen-Knock-out-Zellen (KO). D.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work