Entnahme von Liquor und Blut aus der seitlichen Schwanzvene bei Ratten während EEG-Aufzeichnungen

Zusammenfassung

Das Protokoll zeigt wiederholte Liquor- und Blutentnahmen von epileptischen Ratten, die parallel zur kontinuierlichen Video-Elektroenzephalogramm-Überwachung (EEG) durchgeführt werden. Diese sind von entscheidender Bedeutung, um mögliche Zusammenhänge zwischen Veränderungen verschiedener Körperflüssigkeitsmoleküle und der Anfallsaktivität zu untersuchen.

Zusammenfassung

Da die Zusammensetzung von Körperflüssigkeiten viele physiologische und pathologische Dynamiken widerspiegelt, werden in vielen experimentellen Kontexten üblicherweise biologische Flüssigkeitsproben gewonnen, um Moleküle von Interesse wie Hormone, Wachstumsfaktoren, Proteine oder kleine nicht-kodierende RNAs zu messen. Ein konkretes Beispiel ist die Probenahme biologischer Flüssigkeiten bei der Erforschung von Biomarkern für Epilepsie. In diesen Studien ist es wünschenswert, die Konzentrationen von Molekülen in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und im Plasma zu vergleichen, indem Liquor und Plasma parallel entnommen werden und der zeitliche Abstand der Probenahme von und zu den Anfällen berücksichtigt wird. Die kombinierte Liquor- und Plasmaprobenahme, gekoppelt mit Video-EEG-Monitoring bei epileptischen Tieren, ist ein vielversprechender Ansatz für die Validierung von putativen diagnostischen und prognostischen Biomarkern. Hier wird ein Verfahren der kombinierten Liquorentnahme aus der Cisterna magna und der Blutentnahme aus der lateralen Schwanzvene bei epileptischen Ratten beschrieben, die kontinuierlich per Video-EEG überwacht werden. Dieses Verfahren bietet erhebliche Vorteile gegenüber anderen häufig verwendeten Techniken. Es ermöglicht eine schnelle Probenentnahme mit minimalen Schmerzen oder Invasivität und verkürzter Anästhesiezeit. Darüber hinaus kann es verwendet werden, um Liquor- und Plasmaproben sowohl bei angebundenen als auch bei telemetrischen EEG-aufgezeichneten Ratten zu erhalten, und es kann wiederholt über mehrere Experimenttage hinweg verwendet werden. Durch die Minimierung des Stresses durch die Probenahme durch Verkürzung der Isofluran-Anästhesie sollen die Messungen die wahren Konzentrationen der untersuchten Moleküle in Bioflüssigkeiten genauer widerspiegeln. Abhängig von der Verfügbarkeit eines geeigneten analytischen Assays kann diese Technik verwendet werden, um die Konzentrationen mehrerer verschiedener Moleküle zu messen und gleichzeitig eine EEG-Aufzeichnung durchzuführen.

Einleitung

Liquor cerebrospinalis (CSF) und Blutproben sind wichtig, um Biomarker für Epilepsie zu identifizieren und zu validieren, sowohl in der präklinischen als auch in der klinischen Forschung ^1,2. Heutzutage konzentrieren sich die Diagnose der Epilepsie und die meisten Forschungen zu Epilepsie-Biomarkern auf EEG und Neuroimaging ^3,4,5. Diese Ansätze weisen jedoch einige Einschränkungen auf. Abgesehen von routinemäßigen Kopfhautmessungen erfordert das EEG in vielen Fällen invasive Techniken wie Tiefenelektroden

Protokoll

Alle Versuchsverfahren wurden vom Ausschuss für institutionelle Tierpflege und -verwendung der Universität Ferrara und vom italienischen Gesundheitsministerium (Zulassung: D.M. 603/2022-PR) gemäß den Richtlinien der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften vom 24. November 1986 (86/609/EWG) zum Schutz von Tieren, die für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, genehmigt. Dieses Protokoll ist speziell für weitere quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalysen (qPCR) von kleinen nicht-kodierenden Ribonukleinsäuren (sncRNAs) im Liquor und Plasma der Ratte angepasst, die unter EEG-Kontrolle bei epileptischen Tieren gewonnen wurden. Bitt....

Diskussion

Die vorliegende Arbeit veranschaulicht eine leicht zu beherrschende Technik der Liquor- und Blutentnahme bei Ratten, die nicht nur für Studien in Modellen der Epilepsie, sondern auch für andere neurologische Zustände oder Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson oder Multiple Sklerose nützlich sein kann. In der Epilepsieforschung sind beide Probenahmeverfahren gekoppelt mit Video-EEG ideal, wenn eine Korrelation zwischen den Konzentrationen verschiedener löslicher Moleküle und der Anfallsaktivität angestrebt wird. Aus.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok	BD Italy SpA, Milan, Italy	367246	Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E)	BD Italy SpA, Milan, Italy	365975	Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm	Nipro, Osaka, Japan	PSY-23-ET-ICU	Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R	DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England	112000033	Material
Cotton suture 3-0	Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA	7343H	Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam	Dechra Veterinary Products, Torino, Italy	105183014 (AIC)	Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	PNM-VIDEO-008	Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up	EZVIZ Network, Hangzhou, Cina	EZVIZ (V5.3.2)	Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity	Laboratoire Garcin-Bactinyl, France	LB 920111	Solution
Dummy guide cannula 8 mm	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	CXD-8	Material
Electrode 3-channel two-twisted	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
Electrode holder for stereotxic surgery	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	1776-P1	Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6137	Equipment
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL	Eppendorf Srl, Milan, Italy	30124332	Material
Eppendorf μCuvette G1.0	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	6138	Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo	Zoetis, Rome, Italy	103287025 (AIC)	Solution
Ketamine (Imalgene)	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Lithium chloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	L9650	Material
Microinjection cannula 31G 9 mm	Agn Tho's, Lindigö Sweden	CXMI-9	Material
MP150 modular data acquisition and analysis system	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night	Ursapharm, Milan, Italy	941791927 (AIC)	Material
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	P6503	Material
PTFE Tube with joint	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	JT-10	Material
Saline	0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0		Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S2250	Material
Scopolamine methyl nitrate	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	S1876	Material
Silver sulfadiazine 1% cream	Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy	025561010 (AIC)	Material
Simplex rapid dental methacrylic cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA	Model 963	Equipment
Sucrose solution	10% sucrose in distilled water	Home-made	Solution
Syringe 1 mL	Biosigma, Cona, Venezia, Italy	20,71,26,03,00,350	Material
Telemeters	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	CTA-F40	Material
Telemetry EEG traces analyzer	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	NeuroScore v3-0	Equipment
Telemetry system	Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA	Hardware plus software Ponemah core 6.51	Equipment
Xylazine hydrochloride	Sigma-Aldrich, Milan, Italy	X1251	Material