Knockdown von FAM83A zum Nachweis seiner Rolle beim Zellwachstum von Gebärmutterhalskrebs und der Sensitivität von Cisplatin

Zusammenfassung

Hier zeigen wir die Verfahren für den FAM83A-Knockdown ; die Assays zum Nachweis seiner Auswirkungen auf die Proliferation, Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen; und die Sensibilisierung dieser Zellen gegenüber Cisplatin. Diese Studie liefert ein vielversprechendes Zielgen für Gebärmutterhalskrebs und eine Referenz für die weitere Medikamentenforschung.

Zusammenfassung

Die Erforschung von Tumorzielgenen ist für die Prävention und Behandlung von Gebärmutterhalskrebs von größter Bedeutung. In dieser Studie skizzieren wir die Schritte zur Identifizierung eines Tumor-Zielgens FAM83A bei Gebärmutterhalskrebs. Zunächst wurde der Datensatz des Cancer Genome Atlas verwendet, um die Expression und prognostische Bedeutung von FAM83A bei Frauen zu validieren. Eine kleine interferierende RNA (siRNA) wurde für den Knockdown des FAM83A-Gens in HeLa- und C33a-Zellen verwendet. Als nächstes wurde eine 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EdU)-Färbung durchgeführt, um die Auswirkungen auf die Proliferationsfähigkeit der Tumorzellen zu bestimmen. Wundheilungs- und poröse Membraninsert-Assays wurden durchgeführt, um die Migration und Invasionsfähigkeit von Tumorzellen zu bewerten.

Western Blot wurde verwendet, um Apoptose-assoziierte Proteinspiegel zu quantifizieren. Die JC-1-Färbung wurde verwendet, um Veränderungen der mitochondrialen Funktion zu bewerten. Darüber hinaus wurde die Intervention mit Cisplatin (Diamindichlorplatin, DDP) eingesetzt, um das therapeutische Potenzial des Zielgens zu bewerten. Durchflusszytometrie und Koloniebildungsassays wurden durchgeführt, um die krebshemmenden Eigenschaften des Gens weiter zu validieren. Infolgedessen wurde gezeigt, dass der FAM83A-Knockdown die Proliferation, Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen hemmt und diese Zellen für Cisplatin sensibilisiert. Diese umfassenden Methoden validieren FAM83A als tumorassoziiertes Zielgen, das als potenzielles therapeutisches Ziel in der Prävention und Behandlung von Gebärmutterhalskrebs vielversprechend ist.

Einleitung

Gebärmutterhalskrebs ist ein globales Problem, da es eine der weltweit führenden Arten von gynäkologischen Malignomen ist und die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle bei Frauen ist¹. Radikale Operationen und Radiochemotherapie sind mit hohen Heilungsraten im Primärstadium verbunden. Die Behandlungsergebnisse für Patientinnen im fortgeschrittenen Stadium des Gebärmutterhalskrebses, die eine metastasierende Erkrankung entwickeln, sind jedoch sehr ungünstig². Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die biologischen Mechanismen, die der Migration und Invasion von Gebärmutterhalskrebszellen zugrunde liegen, besser zu....

Protokoll

Die Studie entsprach vollständig den Publikationsrichtlinien der TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Datenquellen- und bioinformatische Analyse

1. Beziehen Sie RNA-Sequenzierungsdaten aus der Datenbank des Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) für die Clusteranalyse. Verwenden Sie GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), ein webbasiertes Tool zur Neuberechnung von RNA-Seq-Rohdaten von Proben aus TCGA-Projekten, um mit einer S....

Diskussion

Die Untersuchung von Tumor-Zielgenen ist sowohl für die Prävention als auch für die Behandlung von Gebärmutterhalskrebs von größter Bedeutung. Das Verständnis der spezifischen Gene, die eine wichtige Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Gebärmutterhalskrebs spielen, bietet wertvolle Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Krankheit. Darüber hinaus kann die Identifizierung dieser Zielgene zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien und zielgerichteter Therapien füh.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
			Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
			RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0