Polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie zur markierungsfreien Amyloid-Strukturcharakterisierung

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird beschrieben, wie polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie angewendet werden kann, um die lokale Organisation in markierungsfreien Amyloid-Superstrukturen-Sphäroliten zu charakterisieren. Außerdem wird beschrieben, wie die Probe vorbereitet und gemessen, der erforderliche Aufbau zusammengestellt und die Daten analysiert werden, um Informationen über die lokale Organisation von Amyloidfibrillen zu erhalten.

Zusammenfassung

Im Vergleich zu ihrem Ein-Photonen-Gegenstück ist die Zwei-Photonen-Anregung für Bioimaging-Experimente von Vorteil, da sie eine geringere Phototoxizität, ein tieferes Eindringen in das Gewebe, einen effizienten Betrieb in dicht gepackten Systemen und eine reduzierte Winkelphotoselektion von Fluorophoren bietet. Die Einführung der Polarisationsanalyse in der Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie (2PFM) ermöglicht somit eine präzisere Bestimmung der molekularen Organisation in einer Probe im Vergleich zu Standard-Bildgebungsverfahren, die auf linearen optischen Verfahren basieren. In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf polarisationsempfindliches 2PFM (ps-2PFM) und seine Anwendung bei der Bestimmung der molekularen Ordnung in komplexen Biostrukturen-Amyloid-Sphäroliten. Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson werden häufig durch den Nachweis von Amyloid-Protein-Aggregaten diagnostiziert, die aufgrund eines gestörten Proteinfehlfaltungsprozesses gebildet werden. Die Erforschung ihrer Struktur führt zu einem besseren Verständnis ihres Entstehungsweges und folglich zur Entwicklung empfindlicherer diagnostischer Methoden. In dieser Arbeit wird das ps-2PFM vorgestellt, das für die Bestimmung der lokalen Fibrillenordnung in den bovinen Insulinsphäroliten und sphärischen amyloidogenen Proteinaggregaten geeignet ist. Darüber hinaus zeigen wir, dass die vorgeschlagene Technik die dreidimensionale Organisation von Fibrillen im Inneren des Sphäruliths auflösen kann.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten wurden zwar zahlreiche fluoreszenzmikroskopische Techniken für die Biobildgebung von Proteinen und ihren Aggregaten^entwickelt 1, aber nur wenige wurden verwendet, um ihre lokale Ordnung innerhalb der Probe aufzulösen ^2,3. Die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie⁴ wurde verwendet, um die intrinsische strukturelle Heterogenität von Amyloid-Superstrukturen-Sphäroliten zu untersuchen. Darüber hinaus konnte die quantitative Bestimmung der lokalen Ordnung in komplexen und dicht gepackten Biostrukturen wie Sphäroliten mit polarisation....

Protokoll

1. Präparation der Objektträger mit ausgewachsenen Sphäroliten

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden. Alle Lösungen wurden mit deionisiertem Wasser (18,2 MΩ·cm bei 25 °C) hergestellt, das aus dem Wasseraufbereitungssystem gewonnen wurde.

1. Inkubieren Sie die Amyloid-Sphärulite auf der Grundlage des von Krebs et al.¹⁶. beschriebenen Protokolls mit einigen Modifikationen, wie unten beschrieben.
   1. Wiegen Sie 10 mg Insulinpulver in einem 1,5-ml-Röhrchen.
   2. Lö....

Diskussion

Die polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der lokalen Anordnung von Fibrillen innerhalb der Amyloid-Überstrukturen, das nur kleine Modifikationen des Standard-Multiphotonen-Aufbaus erfordert. Da sie mit nichtlinearen optischen Phänomenen arbeitet, können im Vergleich zu Methoden der einphotonenangeregten Fluoreszenzmikroskopie eine reduzierte Winkelphotoselektion und eine verbesserte axiale Auflösung erreicht werden. Darüber hinaus führt es zu einer geringe.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5