Erzeugung von Nierenorganoiden in Suspension aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine umfassende und effiziente Methode zur Herstellung von Nierenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung von Suspensionskulturbedingungen dar. Das Hauptaugenmerk dieser Studie liegt auf der Bestimmung der anfänglichen Zelldichte und der WNT-Agonistenkonzentration, was Forschern, die sich für die Erforschung von Nierenorganoiden interessieren, zugute kommt.

Zusammenfassung

Nierenorganoide können aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) durch verschiedene Ansätze erzeugt werden. Diese Organoide sind vielversprechend für die Modellierung von Krankheiten, das Screening von Medikamenten und potenzielle therapeutische Anwendungen. In diesem Artikel wird ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Herstellung von Nierenorganoiden aus iPS-Zellen vorgestellt, beginnend mit dem posterioren primitiven Streifen (PS) bis zum intermediären Mesoderm (IM). Der Ansatz stützt sich auf das Medium APEL 2, bei dem es sich um ein definiertes, tierbaustofffreies Medium handelt. Es wird mit einer hohen Konzentration von WNT-Agonisten (CHIR99021) für eine Dauer von 4 Tagen ergänzt, gefolgt von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 9 (FGF9)/Heparin und einer niedrigen Konzentration von CHIR99021 für weitere 3 Tage. Während dieses Prozesses wird der Schwerpunkt auf die Auswahl der optimalen Zelldichte und CHIR99021 Konzentration zu Beginn von iPS-Zellen gelegt, da diese Faktoren für die erfolgreiche Generierung von Nierenorganoiden entscheidend sind. Ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Suspensionskultur in einer niedrig adhärenten Platte, die es dem IM ermöglicht, sich allmählich zu Nephronstrukturen zu entwickeln, die glomeruläre, proximale tubuläre und distale tubuläre Strukturen umfassen, die alle in einem visuell verständlichen Format präsentiert werden. Insgesamt bietet dieses detaillierte Protokoll eine effiziente und spezifische Technik zur Herstellung von Nierenorganoiden aus verschiedenen iPS-Systemen, um erfolgreiche und konsistente Ergebnisse zu gewährleisten.

Einleitung

Die Niere spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der physiologischen Homöostase, abhängig von ihrer funktionellen Einheit. Nephrone, die Abfallprodukte ausscheiden, können die Zusammensetzung der Körperflüssigkeiten regulieren. Eine chronische Nierenerkrankung (CKD), die durch erbliche Mutationen oder andere Hochrisikofaktoren verursacht wird, entwickelt sich schließlich zu einer Niereninsuffizienz im Endstadium (ESKD)^1,2. ESKD ist offenbar auf die eingeschränkte Regenerationsfähigkeit von Nephronen zurückzuführen. Daher ist eine Nierenersatztherapie erforderlich. Die gerichtete Differenzier....

Protokoll

Die für die vorliegende Studie verwendeten iPS-Zellen wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen. Die Zellen wurden mit mTeSR-Medium auf kommerziell erhältlichen, mit Basalmembranmatrix beschichteten Platten gepflegt (siehe Materialtabelle). Tabelle 1 enthält alle in der Studie verwendeten Medienzusammensetzungen.

1. Beschichtung von iPS-Zellen zur Differenzierung und Induktion eines posterioren primitiven Streifens (PS)

1. Waschen Sie iPS-Zellen auf der membranmatrixbeschichteten 6-Well-Platte mit 2 ml DPBS. Saugen Sie das DPBS mit einer Pipette an.
2. 1 ml der handelsübli....

Diskussion

Es wurde ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von Nierenorganoiden aus iPS-Zellen beschrieben, das geringfügige Modifikationen des Basalmediums, der anfänglichen Zelldichte und der Konzentration von CHIR99021 beinhaltet. In verschiedenen Experimenten wurde festgestellt, dass die entscheidenden Faktoren für eine erfolgreiche Generierung von Nierenorganoiden die anfängliche Differenzierung des intermediären Mesoderms (IM) und der Zellzustand an Tag 7 sind. Darüber hinaus zeigten verschiedene iPSC-Linien Var.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom	NEST	Cat #701003
Accutase	STEMCELL Technologies	Cat #o7920
Antibodies
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	Cat #100-51-6
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	Cat #120-51-4
Biological Safety Cabinet	Haier	Cat #HR40  A2
Biotin anti-human LTL (1:300)	Vector Laboratories	Cat #B-1325
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)	N/A	N/A
Carbon dioxide level shaker	HAMANY	Cat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)	STEMCELL Technologies	Cat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate	Corning	Cat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Corning	Cat #3471
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	Cat #07930
DAPI stain Solution	Coolaber	Cat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo SCIENTIFIC	Cat #D22914
DMEM/F-12 HEPES-free	Servicebio	Cat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	Cat #ab150179
Donkey serum stoste	Meilunbio	Cat #MB4516-1
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)	Solarbio Life Science	Cat #D1040
Dry Bath Incubator	Shanghai Jingxin	Cat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032620
Experimental models: Cell Lines
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Cat #370
Geltre LDEV-Free	Gibco	Cat #A1413202
Glass Bottom Culture Dishes	NEST	Cat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)	Santa Cruz Biotechnology	Cat #sc-20607
Heparin Solution (Cell culture supplement)	STEMCELL Technologies	Cat #07980
Human Recombinant FGF-9	STEMCELL Technologies	Cat #78161
Inverted Microscope	OLYMPUS	Cat #CKX53
Laser Scanning Confocal Microscope	OLYMPUS	Cat #FV3000
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	Cat #M7027
Micro Centrifuge	HENGNUO	Cat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)	BD Biosciences	Cat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)	BD Biosciences	Cat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)	Abcam	Cat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)	Thermo SCIENTIFIC	Cat #39795
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)	Sigma-Aldrich	Cat #81381
mTeSR1 5X Supplement	STEMCELL Technologies	Cat #85852
mTeSR1 Basal Medium	STEMCELL Technologies	Cat #85851
Nunc CryoTube Vials	Thermo SCIENTIFIC	Cat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)	Cell Signaling Technology	Cat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)	Sapphire Bioscience	Cat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)	Abcam	Cat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)	Abcam	Cat #ab89901
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)	Abcam	Cat #ab32570
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)	YEASEN	Cat #20901ES03
Sheep anti-human NPHS1 (1:300)	R&D Systems	Cat #AF4269
STEMdiff APEL 2 Medium	STEMCELL Technologies	Cat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)	Gene Tex	Cat #GTX85902
Versene (1X)	Gibco	Cat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	Cat #72304