Identifizierung, Diagnose und Einstufung bösartiger peripherer Nervenscheidentumoren in gentechnisch veränderten Mausmodellen

Zusammenfassung

Wir haben eine Methodik entwickelt, um zu beurteilen, ob Neubildungen des Nervensystems in gentechnisch veränderten Mäusen die Pathologie ihrer menschlichen Gegenstücke genau rekapitulieren. Hier wenden wir diese histologischen Techniken, definierten pathologischen Kriterien und Kulturmethoden auf Neurofibrome und maligne periphere Nervenscheidentumoren an, die im P 0-GGFβ3-Mausmodell auftreten.

Zusammenfassung

Patienten mit dem autosomal-dominanten Tumoranfälligkeitssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1) entwickeln häufig plexiforme Neurofibrome (PNs), die sich anschließend in hochaggressive maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNSTs) verwandeln. Das Verständnis des Prozesses, durch den sich ein PN in ein MPNST verwandelt, würde durch die Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEM) erleichtert, die das PN-MPNST-Fortschreiten beim Menschen mit NF1 genau replizieren. Leider rekapitulieren GEM-Modelle mit Nf1-Ablation diesen Prozess nicht vollständig. Dies führte uns zur Entwicklung von P 0-GGFβ3-Mäusen, einem GEM-Modell, in dem die Überexpression des Schwann-Zell-Mitogens Neuregulin-1 (NRG1) in Schwann-Zellen zur Entwicklung von PNs führt, die sich mit hoher Frequenz zu MPNSTs entwickeln. Um jedoch festzustellen, ob die Tumorgenese und die neoplastische Progression in P 0-GGFβ3-Mäusen die bei NF1-Patienten beobachteten Prozesse genau modellieren, mussten wir zunächst nachweisen, dass die Pathologie von P_{0-GGFβ3-Tumoren} der peripheren Nervenscheide die Pathologie ihrer menschlichen Gegenstücke rekapituliert.

Hier beschreiben wir die spezialisierten Methoden, die zur genauen Diagnose und Bewertung von Neoplasien des peripheren Nervensystems in GEM-Modellen verwendet werden, wobei P 0-GGFβ3 und P_0-GGFβ3 verwendet werden; Trp53^+/- Mäuse als Beispiel. Wir beschreiben die histologischen, immunhistochemischen und histochemischen Methoden, die zur Diagnose von PNs und MPNSTs verwendet werden, wie man diese Neoplasien von anderen Tumorarten unterscheidet, die ihre Pathologie nachahmen, und wie man diese Neoplasien einstuft. Wir diskutieren die Etablierung von Frühpassagekulturen aus GEM-MPNSTs, wie diese Kulturen mit Hilfe der Immunzytochemie charakterisiert werden können und wie ihre Tumorigenität durch die Etablierung von Allotransplantaten verifiziert werden kann. Zusammengenommen charakterisieren diese Techniken die Pathologie von PNs und MPNSTs, die in GEM-Modellen auftreten, und vergleichen die Pathologie dieser murinen Tumoren kritisch mit ihren menschlichen Gegenstücken.

Einleitung

In den letzten drei Jahrzehnten haben zahlreiche Laboratorien versucht, Mausmodelle für menschliche Krebserkrankungen zu erstellen, indem sie menschliche krebsassoziierte Mutationen in das Mausgenom einführten oder ein Genprodukt überexprimierten, das bei menschlichen Krebsarten überexprimiert wird. Die resultierenden gentechnisch veränderten Mausmodelle (GEM) können für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, z. B. um festzustellen, dass die neu eingeführte genomische Modifikation die Tumorentstehung einleitet, um andere später auftretende genetische oder epigenetische Veränderungen zu identifizieren, die zur Tumorprogression beitragen, und um die wichtigsten Sig....

Protokoll

Die hier beschriebenen Verfahren wurden von der IACUC der Medical University of South Carolina genehmigt und von ordnungsgemäß geschultem Personal in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den institutionellen Tierpflegerichtlinien des MUSC durchgeführt.

1. Bestimmung der Tumorpenetranz und des Überlebens in P 0-GGFβ3-Mäusen und Identifizierung von Tumoren in diesen Tieren zur weiteren Charakterisierung

1. Generieren Sie die Kohorte von Mäusen, die auf Tumorgenese untersucht werden. Die Anzahl der benötigten Mäuse hängt von der Penetranz des Tumorphänotyps a....

Diskussion

Die hier vorgestellten histologischen und biochemischen Methoden bieten einen Rahmen für die Diagnose und Charakterisierung von GEM-Modellen des Neurofibroms und der MPNST-Pathogenese. Im Laufe der Jahre haben wir festgestellt, dass diese Methoden sehr nützlich sind, um die Pathologie von peripheren Nervenscheidentumoren zu beurteilen, die in GEM-Modellen auftreten 21,25,26. Während die hier skizzierten Protokolle nützlich s.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Tissue Culture Plates	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
6- well plates	Corning Costar	3516
Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)	Invitrogen	A11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Cell Scraper	Sarstedt	83.183
Cell Stripper	Corning	25-056-CI
Circle Coverslip	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)	Decon Laboratories	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
Cytokeratin	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Fetal Calf Serum	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Hemacytometer	Brightline-Hauser Scientific	1490
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse	Vector Laboratories	MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i CO2 incubator
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Cell Signaling	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Liquid Nitrogen
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin	Millipore	Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	In house	Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnology	sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice	Jackson Laboratory	5557
Nonfat Dry Milk	Walmart	Great Value Brand
P0-GGFβ3 mice	In house
Paraffin Wax	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)	Fisher Scientific	SP15-100
pH Meter	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Portable Isoflurance Machine	VetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)	Millipore Sigma	10981100ML
Rice Cooker	Beech Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (now GA504)
SMA	Ventana Medical Systems	clone 1A4
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640
Sodium Citrate (Dihydrate)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Cell Signaling	(CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine Blue	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsin	Corning	25-051-31