Verfolgung der miRNA-Freisetzung in extrazelluläre Vesikel mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, das eine In-vitro-Bewertung der Häufigkeit von fluoreszenzmarkierten microRNAs ermöglicht, um die Dynamik der microRNA-Verpackung und des Exports in extrazelluläre Vesikel (EVs) zu untersuchen.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind wichtige Vermittler der zellulären Kommunikation, die von einer Vielzahl unterschiedlicher Zellen abgesondert werden. Diese EVs transportieren bioaktive Moleküle, einschließlich Proteine, Lipide und Nukleinsäuren (DNA, mRNAs, microRNAs und andere nicht-kodierende RNAs), von einer Zelle zur anderen, was zu phänotypischen Folgen in den Empfängerzellen führt. Von all den verschiedenen EV-Ladungen haben microRNAs (miRNAs) aufgrund ihrer eindeutigen Dysregulation und Häufigkeit in EVs viel Aufmerksamkeit für ihre Rolle bei der Gestaltung der Mikroumgebung und bei der Bildung von Empfängerzellen auf sich gezogen. Weitere Daten deuten darauf hin, dass viele miRNAs aktiv in EVs geladen werden. Trotz dieser eindeutigen Beweise ist die Forschung über die Dynamik des Exports und die Mechanismen der miRNA-Sortierung begrenzt. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das die durchflusszytometrische Analyse von EV-miRNA verwendet, um die Dynamik der EV-miRNA-Beladung zu verstehen und die am miRNA-Export beteiligten Maschinen zu identifizieren. In diesem Protokoll werden miRNAs, die in EVs angereichert und aus Spenderzellen abgereichert sind, an ein Fluorophor konjugiert und in die Spenderzellen transfiziert. Die fluoreszenzmarkierten miRNAs werden dann mittels qRT-PCR auf das Laden in EVs und die Depletion aus den Zellen überprüft. Sowohl als Transfektionskontrolle als auch als Werkzeug zum Gating der transfizierten Zellpopulation ist eine fluoreszenzmarkierte zelluläre RNA (zellretiniert und EV-depleted) enthalten. Zellen, die sowohl mit der EV-miRNA als auch mit der zellretinierten miRNA transfiziert wurden, werden über einen Zeitraum von 72 h auf Fluoreszenzsignale untersucht. Die für die EV-miRNAs spezifische Fluoreszenzsignalintensität nimmt im Vergleich zur zellretinierten miRNA rapide ab. Mit diesem einfachen Protokoll konnte man nun die Dynamik der miRNA-Beladung beurteilen und verschiedene Faktoren identifizieren, die für das Laden von miRNAs in Elektrofahrzeuge verantwortlich sind.

Einleitung

MicroRNAs (miRNAs) sind eine der am besten charakterisierten Untergruppen kleiner nicht-kodierender RNAs, die für ihre entscheidende Rolle bei der posttranskriptionellen Genregulation bekannt sind. Die Expression und Biogenese der meisten miRNAs folgt einer koordinierten Abfolge von Ereignissen, die mit der Transkription der primären miRNAs (pri-miRNAs) im Zellkern beginnt. Nach der Kernprozessierung durch den Mikroprozessorkomplex zu Vorläufer-miRNAs (Prä-miRNAs) werden die Prä-miRNAs in das Zytoplasma exportiert, wo sie von der RNase-III-Endonuklease weiterverarbeitet werden, die zu 21-23 nukleotidreifen miRNA-Duplexen verarbeitet wird¹. Eine....

Protokoll

HINWEIS: Als Voraussetzung für die Verwendung dieser Technik ist die Identifizierung und Validierung selektiv exportierter miRNAs erforderlich. Da verschiedene Zelllinien je nach der in ihre EVs einsortierten miRNA-Fracht variieren, wird empfohlen, die interessierende Zelllinie und die zugehörigen EVs vor der Verwendung auf miRNAs zu untersuchen. Darüber hinaus ist die Lipofectamin-basierte Transfektion einer der kritischen Schritte im Protokoll. Es wird empfohlen, die Transfektionseffizienz vor dem Aufbau des Experiments im Voraus zu bestimmen.

1. Züchtung von Zellen in Kultur und Transfizierung von Zellen mit Fluorophor-konjugierter....

Diskussion

Das neu etablierte Protokoll ermöglicht es, die Kinetik der miRNA-Freisetzung in EVs nach der Transfektion von EV-miRNAs zu erfassen. Der Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer EV-miRNAs und Zell-miRNAs, abhängig von den Fähigkeiten des Zytometers. Darüber hinaus kann die Durchflusszytometrie zwar wertvolle Einblicke in die Biologie von EV-miRNAs liefern, ist aber nicht ohne Einschränkungen. Einige der Einschränkungen können jedoch überwunden werden, wenn sie in Verbindung mit anderen Techniken fü.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon tubes	Corning	352097
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	To set up gating and parameters for particle detection
Attune Nxt Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For fluorescence analysis in EVs
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A	For fluorescence analysis in cells
Cell culture incubator	N/A	N/A	Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2
Cell Culture medium	N/A	N/A	specific for the cell-line of interest
Cell line of interest	N/A	N/A	Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)	Horizon discovery	CP-004500-01-05	miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)	Integrated DNA Technologies (IDT)		miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs
Fluorescence microscope	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium	Fisher Scientific	31-985-070
Hausser Scientific Hemocytometer	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA Reverse Transcriptase	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen	339347
mirVana RNA Isolation	Qiagen	AM1561
Nuclease free water	Fisher Scientific	4387936
Paraformaldehyde, 4% in PBS	Fisher	AAJ61899AK
Reagent reservoir nonsterile	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
Trypsin 0.25%	Fisher	SH3004201
Ultracentrifuge	N/A	N/A