Isolierung, Verhaltensidentifikation und Pathogenitätsbewertung von entomopathogenen Pilzen aus einem Waldholzbohrer

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Gewinnung entomopathogener Pilze aus einem Waldholzzünsler vor und eine substituierende Methode zur Bewertung ihrer entomopathogenen Aktivitäten anhand eines Coleoptera-Modellinsekts. Diese Methode ist effizient und praktisch, um entomopathogene Pilzressourcen von holzbohrenden Schadinsekten in natürlichen Wäldern zu erforschen.

Zusammenfassung

Waldholzzünsler (FWB) verursachen weltweit schwere Baumschäden und wirtschaftliche Verluste. Die Freisetzung von entomopathogenen Pilzen (EPF) während der FWB-Schlüpfphase gilt als akzeptable Alternative zur chemischen Bekämpfung. Im Gegensatz zu landwirtschaftlichen Schadinsekten sind die Ressourcen der EPF für FWBs jedoch deutlich weniger erforscht. In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Erkundung von EPF-Ressourcen aus FWBs am Beispiel wilder Monochamus alternatus-Populationen vorgestellt. In diesem Protokoll wird die Zuordnung von Fallen, die mit M beködert sind. alternatus Lockstoffe für verschiedene Populationen garantierten die Entnahme adäquater Proben mit natürlichen Infektionssymptomen während der Schlüpfperioden des Käfers. Nach feinem Präparieren der Integumente und deren Aufbringen auf ein selektives Medium wurden Pilzarten aus jedem Teil des Käferkörpers isoliert und anhand molekularer und morphologischer Merkmale identifiziert.

Mehrere Pilzarten wurden durch Reinfektion von gesunden M. alternatus mit Sporensuspensionen als parasitäre EPFs zertifiziert. Ihre Verhaltensphänotypen an M. alternatus wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie beobachtet und weiter mit denen an der Coleopteran-Modellinsekte Tribolium castaneum verglichen. Bei EPFs, die bei beiden Käferarten konsistente Parasitismus-Phänotypen aufweisen, Bewertung ihrer Aktivitäten auf T. Castaneum lieferte wertvolle Informationen zur Letalität für zukünftige Studien an M. alternatus. Dieses Protokoll half bei der Entdeckung von EPF-Neuinfektionen über M. alternatus-Populationen in China, die als effizienter Ansatz zur Erkundung weiterer EPF-Ressourcen aus anderen FWBs eingesetzt werden könnten.

Einleitung

Die Verwüstung durch Schadinsekten hat zu großen ökologischen und ökonomischen Verlusten sowohl in den Wald- als auch in den Agrarökosystemen geführt. Die meisten landwirtschaftlichen Schädlinge setzen sich natürlichen Feinden oder künstlichen Bekämpfungsmitteln aus und schädigen dabei die Wirtspflanzen. Stattdessen schließt der Waldholzzünsler (FWB) fast seinen gesamten Entwicklungszyklus in den Wirtsbaumstämmen^{ab 1}, was eine große Herausforderung für die Erforschung effizienter biologischer Schädlingsbekämpfungsorganismen aus FWB in der Wildnis darstellt. Noch schlimmer ist, dass FWBs eine große Anzahl von Ph....

Protokoll

1. Isolierung von Pilzen aus M. alternatus (Abbildung 1)

1. Käferprobe entnehmen
   1. Sammeln Sie die Kiefern Sägekäfer M. alternatus mit kommerziellen Fallen (siehe Materialtabelle), die vor den vorhergesagten Schlüpfperioden der Käferpopulationen in natürlich befallenen Kiefernwäldern mit Lockstoffen beködert wurden.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden Käfer aus fünf geografischen Regionen Südchinas (Huzhou/Zhejiang, Liangshan/Sichuan, Xiamen/Fujian, Shaoguan/Guangdong, Yulin/Guangxi) gesammelt. Die Falleneinstellung....

Diskussion

Unterschiedliche geographische Populationen von FWB können aufgrund der langfristigen Anpassung der EPF-Arten an lokale Klimafaktoren und der spezifischen genotypischen Population des Wirtsinsekts unterschiedliche Wechselwirkungen mit den natürlichen entomopathogenen Pilzen entwickeln ^44,45. Die Ausweitung der Probenahmestellen auf mehrere Insektenvorkommensregionen trägt dazu bei, die Möglichkeit zu erhöhen, verschiedene St.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M
10 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettes	Rainin
1,000 µL pipet tips	Sangon Biotech	F630102
2 mL cryogenic vials	Corning	430659
20x PBS buffer	Sangon Biotech	B548117-0500
200 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601227
2,000 bp maker	TaKaRar	SD0531
50 mL tubes	Nest	602052
50% glutaraldehyde solution	Sangon Biotech	G916054
50x TAE buffer	Sangon Biotech	B548101
6x loading buffer	TaKaRar	SD0503
Agarose	Sangon Biotech	A610013
Anhydrous ethanol	Jkchemical	LB10V37
Biochemistry Cultivation Cabinet	Shanghaiyiheng	LRH-250F
Chloroform	Juhua	61553
Commercial beetle traps	FEIMENGDI	BF-8	www.yinyouji.com
Gel imager	Bio-Rad	GelDoc XR+
Glycerol	Sangon Biotech	A600232
High speed refrigerated centrifuge	Sigma	D-37520
High-Pressure Steam Sterilization Pot	Mettler Toledo	JA5003
Isopropyl alcohol	General-reagent	G75885B
Nucleic acid dye	Sangon Biotech	A616696
Optical Microscope, OM	Leica	DM2000
Parafilm	Parafilm	PM996
PCR meter	Heal Force	Trident960
Penicillin G	Marklin	GB15743
Potato dextrose agar, PDA	Oxoid	CM0139
Potato dextrose broth, PDB	Solarbio	P9240
Primers	Sangon Biotech	/
Primers Taq	TaKaRar	RR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation Kit	Sangon Biotech	B518229
Scanning Electron Microscope, SEM	Hitachi	S-3400N
Streptomycin	Marklin	S6153
Tetracycline	Marklin	T829835
Tween-80	Marklin	T6336
Vacuum freeze dryer	Yamato	DC801
Vortex Shaker	HLD	WH-861
β-Mercaptoethanol	Marklin	M6230