Komplementäre Ansätze zur Untersuchung des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden zur quantitativen Analyse der Mitophagie in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse: erstens eine Kombination zellpermeabler Mitochondrien-spezifischer Farbstoffe und zweitens einen genetisch kodierten Mitophagie-Reporter. Diese beiden Techniken ergänzen sich und können je nach Bedarf eingesetzt werden, was Flexibilität und Präzision bei der quantitativen Qualitätskontrolle der Mitochondrien ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Mitophagie ist ein Qualitätskontrollmechanismus, der für die Aufrechterhaltung einer optimalen Mitochondrienfunktion erforderlich ist. Eine dysfunktionale β-Zell-Mitophagie führt zu einer unzureichenden Insulinausschüttung. Fortgeschrittene quantitative Bewertungen der Mitophagie erfordern oft den Einsatz genetischer Reporter. Das mt-Keima-Mausmodell, das eine auf die Mitochondrien abzielende pH-sensitive ratiometrische Sonde mit doppelter Erregung zur Quantifizierung der Mitophagie mittels Durchflusszytometrie exprimiert, wurde in β-Zellen optimiert. Das Verhältnis von sauren zu neutralen mt-Keima-Wellenlängen kann zur robusten Quantifizierung der Mitophagie verwendet werden. Die Verwendung genetischer Mitophagie-Reporter kann jedoch eine Herausforderung darstellen, wenn mit komplexen genetischen Mausmodellen oder schwer zu transfizierenden Zellen, wie z. B. primären menschlichen Inseln, gearbeitet wird. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige komplementäre farbstoffbasierte Methode zur Quantifizierung der β-Zell-Mitophagie in primären Inselzellen mittels MtPhagy. MtPhagy ist ein pH-empfindlicher, zelldurchlässiger Farbstoff, der sich in den Mitochondrien anreichert und ihre Fluoreszenzintensität erhöht, wenn sich Mitochondrien in Umgebungen mit niedrigem pH-Wert befinden, wie z. B. Lysosomen während der Mitophagie. Durch die Kombination des MtPhagy-Farbstoffs mit Fluozin-3-AM, einem^Zn2+ -Indikator, der für β-Zellen selektiert, und Tetramethylrhodamin, Ethylester (TMRE) zur Beurteilung des mitochondrialen Membranpotenzials kann der Mitophagiefluss in β-Zellen mittels Durchflusszytometrie spezifisch quantifiziert werden. Diese beiden Ansätze ergänzen sich in hohem Maße und ermöglichen Flexibilität und Präzision bei der Beurteilung der mitochondrialen Qualitätskontrolle in zahlreichen β-Zell-Modellen.

Einleitung

β-Zellen der Bauchspeicheldrüse produzieren und sezernieren Insulin, um den Stoffwechselbedarf zu decken, und β-Zell-Dysfunktion ist für Hyperglykämie und das Auftreten von Diabetes sowohl bei Typ-1- als auch bei Typ-2-Diabetes verantwortlich. β-Zellen koppeln den Glukosestoffwechsel mit der Insulinsekretion über die mitochondriale Energetik und die Stoffwechselleistung, die von einer Reserve an funktioneller mitochondrialer Masse abhängen ^1,2,3. Um eine optimale β-Zell-Funktion aufrechtzuerhalten, verlassen sich β-Zellen auf mitochondriale Qualitätskontrollmechanismen, um ge....

Protokoll

Die in diesem Protokoll vorgestellten Tierstudien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Michigan geprüft und genehmigt. Für diese Studie wurden zwanzig Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse verwendet, die entweder eine 15-wöchige normale Fettdiät (RFD) oder eine fettreiche Diät (HFD) erhielten.

1. Beurteilung der Mitophagie mit dem farbstoffbasierten MtPhagy-Ansatz (Methode 1)

1. Aufbereitung und Behandlung von Mäuseinseln
   1. Führen Sie die Inselkultur und die Valinomycin-Exposition durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
      1. Isolierung von Inselzellen aus Mäusen mi....

Diskussion

Dieses Protokoll beschrieb zwei komplementäre Methoden zur Quantifizierung des Mitophagieflusses in dissoziierten primären Mausinseln. Mit der mt-Keima-Methode wurde ein Anstieg der Mitophagie als erhöhtes Verhältnis von sauren (561 nm) / neutralen (405 nm) Zellen quantifiziert, während in der MtPhagy-Methode ein erhöhter Mitophagiefluss als Anstieg der niedrigen Zellpopulation mit Fluozin-hohemMtPhagy-hohem TMRE-Wert quantifiziert wurde. Diese Methoden ermöglichen eine schnelle, q.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Attune NxT Flow Cytometer	Thermofisher Scientific	A24858
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermofisher Scientific	D1306	DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder	Equitech	BAH66
Fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)	Life Technologies	11360-070	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]	Anaspec	AS-88061	TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.