Extraktion von Diatomeen-DNA aus Wasserproben und Geweben

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die DNA-Extraktion von Kieselalgen unter Verwendung eines modifizierten gemeinsamen DNA-Extraktionskits.

Zusammenfassung

Die Untersuchung von Kieselalgen ist ein wesentliches Hilfsmittel in der forensischen Praxis, um festzustellen, ob die Leiche im Wasser ertrunken ist, und um auf den Ertrinkungsort zu schließen. Auch im Bereich Umwelt und Plankton ist die Untersuchung von Kieselalgen ein wichtiger Forschungsinhalt. Die molekularbiologische Testtechnologie für Kieselalgen, die sich auf die Kieselalgen-DNA als primäres Forschungsobjekt konzentriert, ist eine neue Methode der Kieselalgen-Testung. Die DNA-Extraktion von Kieselalgen ist die Grundlage für molekulare Tests von Kieselalgen. Derzeit sind die Kits, die üblicherweise für die DNA-Extraktion von Kieselalgen verwendet werden, teuer, was die Kosten für die Durchführung entsprechender Forschungen erhöht. Unser Labor hat das allgemeine Vollblut-Genom-DNA-Schnellextraktionskit verbessert und einen zufriedenstellenden DNA-Extraktionseffekt für Kieselalgen erzielt, wodurch eine alternative, wirtschaftliche und erschwingliche DNA-Extraktionslösung auf der Basis von Glasperlen für verwandte Forschungen bereitgestellt wird. Die mit diesem Protokoll extrahierte Diatomeen-DNA könnte viele nachgelagerte Anwendungen wie PCR und Sequenzierung erfüllen.

Einleitung

In der forensischen Praxis ist die Feststellung, ob eine im Wasser gefundene Leiche ertrunken ist oder nach dem Tod ins Wasser geworfen wurde, für die ordnungsgemäße Lösung des Falles^{unerlässlich 1}. Es ist auch eines der schwierigen Themen, die in der forensischen Praxis dringend gelöst werden müssen². Kieselalgen sind in der Natur (insbesondere im Wasser) reichlich ^vorhanden3,4. Während des Prozesses des Ertrinkens haben die Menschen aufgrund von Hypoxie und Stressreaktion intensive Atembewegungen und atmen eine große Menge Ertrinkungsflüssigkeit ein. Daher gelangen die Kieselalgen im Wasser mit der ertrinkenden Flüssigkeit in die Lunge, und einige Kieselalgen können durch die Alveolar-Kapillar-Barriere in den Blutkreislauf gelangen und sich mit dem Blutfluss auf innere Organe ausbreiten ^5,6. Der Nachweis von Kieselalgen in inneren Geweben und Organen wie Lunge, Leber und Knochenmark ist ein starker Beweis für das Ertrinken vor dem Tod ^7,8. Derzeit basiert die forensische Untersuchung von Kieselalgen hauptsächlich auf morphologischen Testmethoden. Nach einer Reihe von Vorverdauungen des Gewebes werden die morphologischen, qualitativen und quantitativen Schätzungen der unverdauten Kieselalgen unter dem Mikroskop durchgeführt. Während dieser Zeit müssen gefährliche und umweltschädliche Reagenzien wie Salpetersäure verwendet werden. Dieser Prozess ist zeitaufwändig und erfordert von den Forschern ein solides taxonomisches Fachwissen und umfangreiche Erfahrung. All dies stellt das forensische Personal vor gewisse Herausforderungen⁹. Die Diatomeen-DNA-Testtechnologie ist eine neue Technologie für Diatomeentests, die in den letzten Jahren entwickelt wurde 10,11,12. Diese Technologie realisiert die Speziesidentifikation von Kieselalgen durch Analyse der spezifischen DNA-Sequenzzusammensetzung von Kieselalgen^13,14. Die PCR-Technologie und die Sequenzierungstechnologie sind häufig verwendete technische Methoden, deren Grundlage jedoch die erfolgreiche Extraktion von DNA aus Kieselalgen ist. Kieselalgen haben jedoch eine spezielle Struktur, die sich von anderen Organismen unterscheidet, wodurch sich auch ihre DNA-Extraktionstechniken unterscheiden.

Die Zellwand der Kieselalge weist einen hohen Verkieselungsgrad auf, und ihr Hauptbestandteil ist Siliziumdioxid 15,16,17. Die kieselsäurehaltige Zellwand ist sehr hart und muss zerstört werden, bevor die DNA extrahiert werden kann. Gewöhnliche DNA-Extraktionskits sind oft schwierig direkt für die Extraktion von Kieselalgen-DNA zu verwenden, da sie die kieselsäurehaltige Schale von Kieselalgen nicht zerstören können¹⁸. Daher ist die Zerstörung der kieselsäurehaltigen Schale von Kieselalgen eines der wichtigsten technischen Probleme, die bei der Extraktion von Kieselalgen-DNA gelöst werden müssen.

Da die Anzahl der Kieselalgen, die in forensischen Forschungsproben enthalten sind, seien es Wasserproben oder Organe und Gewebe von ertrunkenen Körpern, oft begrenzt ist, ist es gleichzeitig notwendig, Kieselalgen anzureichern. Das Wesen der Anreicherung ist die Trennung von Substanzen. Wenn Sie versuchen, Kieselalgen zu sammeln, minimieren Sie den Gehalt an anderen Materialkomponenten (störende Komponenten). Bei forensischen Arbeiten verwenden Laboratorien häufig Zentrifugations- oder Membranfiltrationsanreicherungsmethoden, um Diatomeenzellen zu trennen¹⁹. Da Vakuumpumpen jedoch nicht weit verbreitet sind, wird die Methode der Membrananreicherung in gewöhnlichen forensischen Primärlabors nicht häufig eingesetzt. Daher ist die Zentrifugationsmethode immer noch üblicherweise die Anreicherung von Kieselalgen in forensischen Laboratorien²⁰.

Die DNA-Extraktion aus Kieselalgen wird derzeit vor allem in der forensischen Praxis eingesetzt, und es gibt erhebliche Einschränkungen bei ihrer Anwendung. Derzeit gibt es auf dem Markt nur wenige DNA-Extraktionskits für Kieselalgen, die in der Forensik verwendet werden, und sie sind im Allgemeinen teuer²¹. In diesem Artikel wird eine verbesserte Methode zur Extraktion von Kieselalgen-DNA vorgestellt, die die Extraktion von Kieselalgen-DNA einfach, bequem und kostengünstig macht. Dies erhöht die Anwendung der anschließenden molekularbiologischen Untersuchung von Kieselalgen und kann Probleme im Zusammenhang mit dem Ertrinken in der Gerichtsmedizin durch Kieselalgentests besser lösen. Diese Methode bricht die kieselsäurehaltigen Zellwände von Kieselalgen auf, indem Glasperlen hinzugefügt und eine geeignete Zeit für den Wirbel festgelegt wird. Auf diese Weise lysieren die Proteinase K und die Bindungslösung die Zellen schnell und inaktivieren verschiedene Enzyme in den Zellen. Die genomische DNA wird in der Matrixmembran in der Adsorptionssäule absorbiert und schließlich durch den Elutionspuffer eluiert. Ein solches verbessertes Vollblut-Genextraktionskit verbessert den Diatomeen-DNA-Extraktionseffekt des Blutkits in forensischen Untersuchungsmaterialien, reduziert die Kosten für die Diatomeen-DNA-Extraktion in der forensischen Praxis und kann besser auf die forensische Forschung an der Basis angewendet werden.

Protokoll

Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Hainan Medical University genehmigt. Die in dieser Studie verwendeten Gewebeproben gelten nicht als Studien mit menschlichen Probanden. Diese Proben wurden für die forensische pathologische Diagnose gewonnen, der Rest wurde für die Extraktion von Kieselalgen-DNA in diesem Experiment verwendet. Forscher können nicht ohne weiteres Personen identifizieren, um die informierte Zustimmung der relevanten Interessengruppen einzuholen.

HINWEIS: Um die allgemeine Anwendbarkeit der in diesem Experiment berichteten Forschungsmethode zu gewährleisten, folgte dieses Experiment im Wesentlichen der Bedienungsanleitung des verwendeten Kits, und es wurden nur einige Schritte geändert. Die in diesem Experiment verwendeten Wasserproben wurden nach dem Zufallsprinzip aus Teichen in der Nähe des Labors entnommen (Ergänzende Abbildung 1A). In diesem Experiment wurde das Lungengewebe des ertrunkenen Körpers als Forschungsgewebe bestätigt, um das Extraktionsprotokoll zu demonstrieren (Ergänzende Abbildung 1B). In der forensischen Praxis ist es manchmal auch notwendig, andere Organe und Gewebe von ertrunkenen Körpern (wie Leber, Milz, Niere, Knochenmark usw.) zu verwenden, um die DNA von Kieselalgen zu extrahieren, was geringfügige entsprechende Verbesserungen dieser experimentellen Methode erfordert, die im entsprechenden Abschnitt des Experiments erläutert werden. Die in diesem Experiment verwendeten Lungengewebeproben stammten von Leichen, die eindeutig in forensischen Fällen ertrunken waren. Es wurden morphologische Tests durchgeführt, um nachzuweisen, dass das Lungengewebe Kieselalgen enthält (Ergänzende Abbildung 2).

1. Vorbehandlung der Proben

1. Vorbehandlung von Wasserproben
   1. Nehmen Sie 10 ml Wasserprobe in das Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 13.400 x g . 9,8 ml Überstand vorsichtig mit einer Pipettenpistole entsorgen und etwa 200 μl angereicherte Kieselalgenwasserprobe, die am Boden verbleibt, in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
      HINWEIS: Zuerst kann ein Vorexperiment durchgeführt werden, und die Anfangsmenge kann erhöht werden, wenn eine 10-ml-Wasserprobe für die Anreicherung nicht ausreicht.
2. Vorbehandlung von Gewebeproben
   1. Entnehmen Sie 0,5 g des Lungenrandgewebes aus dem ertrunkenen Körper, hacken oder zerkleinern Sie das Lungengewebe vollständig, bis es schlammig wird. Die Verhinderung der Kontamination von exogenen Kieselalgen ist der Kern dieses Schritts. Schneiden Sie das Gewebe wiederholt mit einer Schere in Stücke.

2. DNA-Extraktion

HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Verwendung einer Tischzentrifuge mit einer Zentrifugalkraft von 14.500 x g; Vor Beginn des Experiments muss ein auf 70 °C vorgeheiztes Wasserbad (oder Metallbad) vorbereitet werden. Alle Schritte müssen streng nach den Grundsätzen des aseptischen Betriebs erfolgen.

1. Zusammenstellung von Wasserproben und Geweben
   HINWEIS: Die DNA-Extraktionsmethode für Wasserproben und Gewebekieselalgen ist identisch.
   1. Glasperlen in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen geben, das die vorbehandelte Wasserprobe enthält. 10x-15x invertieren, um gut zu mischen. Die zugesetzten Glasperlen setzen sich aus großen und kleinen Glasperlen zusammen, die in einem Massenverhältnis von 1:1 gemischt sind. Der Durchmesser der großen Glasperlen beträgt 1,5-2,0 mm und der der kleinen Glasperlen 0,4-0,6 mm.
   2. Nehmen Sie 0,5 g fein gehacktes Gewebe und geben Sie Glasperlen in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen, das das Gewebe enthält, wie oben beschrieben. 10x-15x invertieren, um zu mischen.
2. Geben Sie 40 μl Proteinase K (20 mg/ml) in die Röhrchen. 15 Minuten bei Raumtemperatur stellen, in dieser Zeit umdrehen und alle 3 Minuten 10x mischen.
   HINWEIS: Wenn das Gewebe nicht vollständig verdaut ist, kann die Menge an Proteinase K entsprechend erhöht werden, bis die Lösung klar wird.
3. 200 μl Bindepuffer in die Zentrifugenröhrchen geben, sofort vortexen und 4 min mischen (Oszillationsmischfrequenz: 3000 U/min).
   HINWEIS: In diesem Schritt sollten die Schüttelintensität und -zeit streng kontrolliert werden, um eine ausreichende Mischintensität und -zeit zu gewährleisten.
4. Die Zentrifugenröhrchen für 10 min in ein 70 °C warmes Wasserbad geben, dann wird die Lösung klar.
5. Geben Sie 100 μl Isopropanol in die Zentrifugenröhrchen, wirbeln Sie vor und mischen Sie 15 s lang, zu diesem Zeitpunkt kann es zu einer Ausfällung von Flockungsmitteln kommen.
   HINWEIS: Es ist sehr wichtig, in den oben genannten Operationsschritten gut mit entsprechender Stärke zu mischen, aber starkes Schütteln sollte vermieden werden, um DNA-Scherungen zu vermeiden.
6. Die im vorherigen Schritt erhaltene Lösung wird zusammen mit dem Flockungsmittelniederschlag in die Adsorptionskolonne gegeben (die Adsorptionssäule wird in das Sammelröhrchen gestellt). Die Länge der Adsorptionssäule beträgt 3,0 cm, der Durchmesser 1,0 cm und die Adsorptionsmatrix ist eine Siliziummatrixmembran.
7. Bei 8.000 x g 30 s zentrifugieren, die Abfallflüssigkeit im Sammelröhrchen entsorgen und die Adsorptionssäule wieder in das Sammelröhrchen einsetzen.
8. 500 μl Inhibitorentfernungspuffer in die Adsorptionssäule geben. Bei 13.400 x g 30 s zentrifugieren und die Abfallflüssigkeit im Sammelröhrchen entsorgen.
9. 700 μl Waschpuffer in die Adsorptionssäule geben. Bei 13.400 x g 30 s zentrifugieren und die Abfallflüssigkeit im Sammelröhrchen entsorgen.
   HINWEIS: Geben Sie vor dem ersten Gebrauch die angegebene Menge an absolutem Ethanol in die Waschpufferflasche.
10. 500 μl Waschpuffer in die Adsorptionssäule geben. Bei 13.400 x g 30 s zentrifugieren und die Abfallflüssigkeit im Sammelröhrchen entsorgen.
11. Setzen Sie die Adsorptionssäule wieder in das leere Sammelröhrchen ein. Bei 14.500 x g für 2 min zentrifugieren und den Waschpuffer so weit wie möglich entfernen, um zu vermeiden, dass das restliche Ethanol im Waschpuffer nachgeschaltete Reaktionen hemmt.
12. Nehmen Sie die Adsorptionssäule heraus und geben Sie sie in ein sauberes Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 100 μl Elutionspuffer in den mittleren Teil der Adsorptionsmembran.
13. Die Adsorptionssäule wird für 3-5 Minuten bei Raumtemperatur platziert und 1 Minute lang bei 13.400 x g zentrifugiert.
14. Die im vorherigen Schritt erhaltene Lösung wird wieder in die zentrifugale Adsorptionskolonne gegeben. Die Zentrifugaladsorptionssäule wird 2 min lang bei Raumtemperatur und 1 min bei 13.400 x g zentrifugiert.
    HINWEIS: Der Elutionspuffer sollte in einem 70 °C warmen Wasserbad für ca. 10 min vorgewärmt werden. Das Elutionsvolumen sollte nicht weniger als 50 μl betragen; Andernfalls wird die DNA-Ausbeute reduziert.
15. Lagern Sie die extrahierte Kieselalgen-DNA für die zukünftige Verwendung bei 2-8 °C. Wenn die DNA-Lösung längere Zeit gelagert werden soll, lagern Sie sie bei -20 °C.

3. PCR-Test

HINWEIS: Da der Gehalt an Kieselalgen in forensischen Proben oft gering ist, können die Gewebeprobenextrakte der ertrunkenen Leichen auch unterschiedlich starke Gewebe und Organe (wie z.B. die Lunge in diesem Experiment) mit eigener DNA enthalten. Daher spiegelt der direkte Nachweis der Gesamt-DNA in DNA-Extrakten nicht die Situation der Kieselalgen-DNA-Extraktion wider. In diesem Experiment wurden Diatomeen-spezifische Primer ausgewählt und PCR-Produkte verwendet, um die Diatomeen-DNA-Extraktion im Extrakt zu bewerten. Die Produkte können durch Agarose-Gelelektrophorese beobachtet und analysiert werden und können auch durch eine quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Schmelzkurve analysiert werden, die eine höhere Empfindlichkeit aufweist.

1. Fügen Sie 2 μl der extrahierten DNA aus Wasserproben und Geweben als Vorlage hinzu. Wählen Sie eine der beiden folgenden Inspektionsmethoden aus.
2. Konventioneller PCR-Test
   1. Verwenden Sie Primer²² , die Kieselalgen-18S-rDNA-Fragmente spezifisch amplifizieren können. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 1.
   2. Legen Sie das PCR-Reaktionssystem und die Amplifikationsbedingungen entsprechend den Eigenschaften der Primer fest. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 2.
   3. Führen Sie die Produkte der PCR-Amplifikation auf 2%igem Agarose-Gel aus. Beobachten und analysieren Sie die Bildgebung mit einem Gel-Imager.
3. Fluoreszierender quantitativer PCR-Test
   1. Verwenden Sie die oben genannten Primer, die Diatomeen-18S-rDNA-Fragmente spezifisch amplifizieren können, um ein quantitatives Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Reaktionssystem herzustellen. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 3.
   2. Führen Sie eine PCR-Amplifikation durch und analysieren Sie die erhaltene Amplifikationskurve und die Ct-Werte. Stellen Sie gleichzeitig ein Programm ein, schmelzen Sie die Doppelstränge der amplifizierten Produkte schrittweise durch fluoreszierende quantitative PCR-Schmelzkurventechnologie in Einzelstränge und analysieren Sie dann die erhaltenen Schmelzkurven.

Ergebnisse

Da die DNA-Lösung, die mit der derzeit verwendeten DNA-Extraktionsmethode extrahiert wird, alle DNA-Bestandteile aus verschiedenen Quellen in der Probe enthält, war die durch dieses Protokoll gewonnene DNA keine Ausnahme. Die DNA-Lösung war also nicht nur eine Lösung der genomischen DNA von Kieselalgen. Die Primer, die Diatomeen-18S-rDNA-Fragmente spezifisch amplifizieren können, wurden unter Konsultation der Literatur^ausgewählt 22,23,24.

Diskussion

Kieselalgenzellen sind durch harte kieselsäurehaltige Zellwände¹⁷ geschützt, und diese Struktur muss zerstört werden, um Kieselalgen-DNA zu extrahieren. Gewöhnliche Kits zerstören die kieselsäurehaltige Schale von Kieselalgen nicht leicht; Daher ist es schwierig, Diatomeen-DNA erfolgreich zu extrahieren²¹. Unser Labor hat das am häufigsten verwendete Blut-DNA-Extraktionskit verbessert, indem es Glasperlen mit unterschiedlichen Durchmessern und unterschiedlichen Mass...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binding Buffer	BioTeke	B010006022	rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR Mix	Monad	00007547-120506	qPCR Mix
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
D512	Taihe Biotechnology	TW21109196	forword primer
D978	Taihe Biotechnology	TW21109197	reverse primer
Elution buffer	BioTeke	B010006022	A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass bead	Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)	70181000	Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption column	BioTeke	B2008006022	Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal Buffer	BioTeke	B010006022	Removal of Inhibitors in DNA Extraction
Isopropanol	BioTeke	B010006022	Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	BioTeke	B010006022	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRM	Qiagen	R1116175	real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Wash Buffer	BioTeke	B010006022	Remove impurities such as cell metabolites