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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von iTenozyten durch die Erzeugung von iPSC-abgeleiteten mesenchymalen Stromazellen mit kombinierter Überexpression von Sklerose unter Verwendung eines lentiviralen Vektors und uniaxialer Streckung über einen 2D-Bioreaktor.

Zusammenfassung

Die heutigen Herausforderungen in der Sehnen- und Bänderreparatur erfordern die Identifizierung eines geeigneten und wirksamen Kandidaten für eine zellbasierte Therapie zur Förderung der Sehnenregeneration. Mesenchymale Stromazellen (MSCs) wurden als potenzielle Tissue-Engineering-Strategie für die Sehnenreparatur untersucht. Obwohl sie multipotent sind und in vivo ein regeneratives Potenzial haben, sind sie in ihrer Selbsterneuerungsfähigkeit begrenzt und weisen eine phänotypische Heterogenität auf. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) können diese Einschränkungen aufgrund ihrer hohen Selbsterneuerungsfähigkeit und ihrer beispiellosen Entwicklungsplastizität umgehen. In der Tenozytenentwicklung ist die Skleraxis (Scx) ein entscheidender direkter molekularer Regulator der Sehnendifferenzierung. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die Mechanoregulation ein zentrales Element ist, das die embryonale Sehnenentwicklung und -heilung steuert. Aus diesem Grund haben wir ein Protokoll entwickelt, um den synergistischen Effekt biologischer und mechanischer Stimulation zu erfassen, der für die Bildung von Tenozyten unerlässlich sein kann. iPS-Zellen wurden zu mesenchymalen Stromazellen (iMSCs) induziert und mittels Durchflusszytometrie mit klassischen mesenchymalen Stromazellmarkern charakterisiert. Als nächstes wurden die iMSCs mit Hilfe eines lentiviralen Vektors transduziert, um SCX stabil zu überexprimieren (iMSCSCX+). Diese iMSCSCX+ Zellen können durch einachsige Zugbelastung mit einem 2D-Bioreaktor zu iTenozyten weiter gereift werden. Die resultierenden Zellen wurden durch die Beobachtung der Hochregulierung von frühen und späten Sehnenmarkern sowie der Kollagenablagerung charakterisiert. Diese Methode zur Generierung von iTenozyten kann verwendet werden, um Forscher bei der Entwicklung einer potenziell unbegrenzten allogenen Zellquelle von der Stange für Sehnenzelltherapieanwendungen zu unterstützen.

Einleitung

Um die aktuellen Probleme bei der Reparatur von Sehnen und Bändern anzugehen, ist ein entsprechender Zellkandidat erforderlich, der für zellbasierte Therapien geeignet ist. Ein Forschungsansatz im Bereich des Tissue Engineering für die Sehnenreparatur ist die Erforschung von aus dem Knochenmark stammenden mesenchymalen Stromazellen (BM-MSCs) und aus Fettgewebe gewonnenen Stromazellen (ASCs) als mögliche Strategien. Diese Zellen verfügen über multipotente Fähigkeiten, eine große Häufigkeit und ein regeneratives Potenzial in vivo. Darüber hinaus haben sie eine verbesserte Heilungskapazität und verbesserte funktionelle Ergebnisse in Tiermodellen gezeigt1. Nichtsdestotrotz weisen diese Zellen eine eingeschränkte Selbsterneuerungsfähigkeit, eine phänotypische Diversität und vor allem eine begrenzte Fähigkeit zur Sehnenbildung auf. Die Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) bietet aufgrund ihrer bemerkenswerten Selbsterneuerungsfähigkeit und ihrer unübertroffenen Entwicklungsanpassungsfähigkeit eine Lösung für diese Einschränkungen. Unserem Forschungsteam und anderen ist es gelungen, iPS-Zellen erfolgreich in mesenchymale stromazellähnliche Einheiten (iMSCs) zu differenzieren2,3. Daher haben iMSCs das Potenzial, eine allogene Quelle für Sehnenzelltherapieanwendungen zu sein.

Die Skleraxis (SCX) ist ein Transkriptionsfaktor, der für die Sehnenentwicklung essentiell ist und gilt als der früheste nachweisbare Marker für differenzierte Tenozyten. Darüber hinaus aktiviert SCX nachgeschaltete Sehnendifferenzierungsmarker, darunter Typ-1a1-Kettenkollagen 1 (COL1a1), Irokesenschnitt (MKX) und Tenomodulin (TNMD), unter anderem 4,5,6. Andere Gene, die während der Sehnenreifung exprimiert werden, sind das Tubulin-Polymerisations-fördernde Proteinfamilienmitglied 3 (TPPP3) und der Thrombozyten-abgeleitete Wachstumsfaktor-Rezeptor alpha (PDGFRa)7. Diese Gene sind zwar essentiell für die Entwicklung und Reifung von Sehnen, kommen aber leider nicht nur im Sehnengewebe vor, sondern werden auch in anderen Muskel-Skelett-Geweben wie Knochen oder Knorpel exprimiert 5,7.

Neben der Expression von Markern während der Sehnenentwicklung ist die Mechanostimulation ein wesentliches Element für die embryonale Sehnenentwicklung und -heilung 4,5,6. Sehnen sind mechanoresponsive und ihre Wachstumsmuster ändern sich als Reaktion auf ihre Umgebung. Auf molekularer Ebene beeinflussen biomechanische Signale die Entwicklung, Reifung, Erhaltung und Heilungsreaktionen von Tenozyten8. Verschiedene Bioreaktorsysteme wurden verwendet, um physiologische Belastungen und biomechanische Signale zu modellieren. Einige dieser Modellsysteme umfassen ex vivo Gewebebeladung, 2D-Zellladesysteme, die biaxiale oder uniaxiale Spannung anwenden, und 3D-Systeme mit Gerüsten und Hydrogelen 9,10. 2D-Systeme sind vorteilhaft, wenn es darum geht, die Auswirkungen der mechanischen Stimulation auf sehnenspezifische Gene oder die Morphologie der Zellen im Zusammenhang mit dem Zellschicksal zu untersuchen, während 3D-Systeme Zell-EZM-Interaktionen genauer replizieren können 9,10.

Bei 2D-Ladesystemen ist die Spannung zwischen den Zellen und dem Kultursubstrat homogen, was bedeutet, dass die Belastung des Zytoskeletts der Zellen vollständig kontrolliert werden kann. Im Vergleich zur biaxialen Belastung ist die einachsige Belastung physiologisch relevanter, da Tenozyten in vivo überwiegend einer einachsigen Belastung durch Kollagenbündel ausgesetzt sind 9. Es wurde festgestellt, dass Sehnen bei täglichen Aktivitäten einer einachsigen Zugbelastung von bis zu 6 % Dehnungausgesetzt sind 11. Insbesondere haben frühere Studien gezeigt, dass eine Belastung im physiologischen Bereich von 4 % bis 5 % die tenogene Differenzierung fördert, indem die sehnenbezogene Markerexpression wie SCX und TNMD erhalten bleibt und die Kollagenproduktion erhöhtwird 9,10. Stämme von mehr als 10 % können traumatisch, aber nicht physiologisch relevant sein12,13.

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das den synergistischen Effekt der mechanischen und biologischen Stimulation berücksichtigt, der für die Bildung von Tenozyten essentiell sein kann. Wir beschreiben zunächst eine reproduzierbare Methode zur Induktion von iPS-Zellen in iMSCs durch kurzzeitige Exposition von Embryoidkörpern gegenüber Wachstumsfaktoren, die durch MSC-Oberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie bestätigt wird. Anschließend beschreiben wir eine lentivirale Transduktionsmethode, um iMSCs so zu manipulieren, dass sie eine stabile Überexpression von SCX (iMSCSCX+) aufweisen. Für die weitere Zellreifung werden die iMSCSCX+ in Fibronektin-beschichtete Silikonplatten eingeschleust und mit dem CellScale MCFX-Bioreaktor einem optimierten uniaxialen Spannungsprotokoll unterzogen. Das tenogene Potenzial wurde durch die Beobachtung der Hochregulierung von frühen und späten Sehnenmarkern sowie der Kollagenablagerung bestätigt14. Diese Methode zur Generierung von iTenozyten ist ein Proof-of-Concept, der eine unbegrenzte, allogene Standardquelle für Sehnenzelltherapieanwendungen bieten könnte.

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Protokoll

Dieses Protokoll zur Herstellung von iTenozyten kann in drei Hauptschritten durchgeführt werden: iPSCs zu iMSCs (10 Tage), iMSC zu iMSCSCX+ (2 Wochen), iMSCSCX+ zu iTenozyten (mindestens 4 Tage). Jeder wichtige Schritt im Protokoll kann je nach experimentellem Zeitplan pausiert und später neu gestartet werden. Für Methoden, die mit der Kultivierung von Zellen verbunden sind, sollten sterile Techniken angewendet werden. Alle Zellen in diesem Protokoll sollten bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit gezüchtet werden.

1. Humane iPSC-Induktion in induzierte mesenchymale Stromazellen (iMSCs)

  1. Vorbereitung von Experimenten
    1. Bereiten Sie Iscoves Modified Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies (IMDM-EB) Medium vor.
      1. Ergänzen Sie 50 ml IMDM-Basalmedien mit 8,5 ml Knock-out-Serumersatz, 500 μl nicht-essentiellen Aminosäuren des minimalen essentiellen Mediums (MEM), 0,385 μl (110 mM Stamm) Beta-Mercaptoethanol und 500 μl antibiotisch-antimykotischer Lösung (AAS) (Endkonzentrationen: 17 %, 1 %, 110 μM, jeweils 1 %) (siehe Materialtabelle).
    2. Bereiten Sie mesenchymale Stromazellen (MSC) vor.
      1. Ergänzen Sie 440 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit niedrigem Glukosegehalt mit 50 ml fötalem Kälberserum (FBS), 5 ml antibiotisch-antimykotischer Lösung (AAS) und 5 ml L-Glutamin (Endkonzentrationen: 10 %, 1 %, 2 mM).
    3. Bereiten Sie mit Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (Poly-HEMA) beschichtete Platten vor.
      1. Geben Sie 10 g des Poly-HEMA (siehe Materialtabelle) in eine sterile Flasche.
      2. Geben Sie einen Magnetrührer in die Flasche und fügen Sie unter Rühren langsam 500 ml 95% EtOH hinzu.
      3. Sobald das gesamte EtOH zugegeben wurde, schalten Sie den Rührmodus bei 1200 U/min mit zusätzlicher niedriger Hitze für mindestens 6 h ein. Die Poly-HEMA-Lösung kann bei Raumtemperatur bis zu einem Jahr gelagert werden.
      4. Unter sterilen Bedingungen 2,5 μg/cm2 in 9 ml in einen T75-Kolben geben. Passen Sie das Volumen an die Größe des Kulturgefäßes an.
      5. Um die Sterilität zu wahren, lassen Sie die Gefäße an der Luft trocknen, damit das EtOH vor der Verwendung vollständig verdunsten kann. Dies dauert in der Regel 24-72 h.
    4. Bereiten Sie mit Gelatine überzogene Kolben vor.
      1. Waschen Sie eine Glasflasche mit NaOH und widmen Sie sie der Gelatinezubereitung. Verwenden Sie kein Reinigungsmittel.
      2. Bereiten Sie 1%ige Gelatinelösung (5 g Gelatine und 500 ml endotoxinfreies Wasser) vor. Autoklavieren Sie die Glasflasche mit der Gelatinelösung für 30 Minuten.
      3. Lassen Sie die Gelatinelösung abkühlen und sie kann bei Raumtemperatur gelagert werden.
      4. Einen T75-Kolben mit 5 ml Gelatinelösung pro Kolben bestreichen und vor der Aussaat der Zellen mindestens 1 Stunde lang inkubieren. Mit Gelatine überzogene Kolben können 1 Tag im Voraus zubereitet werden.
    5. Bereiten Sie den Puffer für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) vor.
      1. Mischen Sie PBS mit 2 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Natriumazid. Bei 4 °C lagern.
  2. Generierung von Embryoidkörpern (EBs)
    HINWEIS: iPS-Zellen sollten in einer 6-Well-Platte kultiviert werden und vor der Verwendung eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen.
    1. Bringen Sie an Tag 0 eine 384 PCR-Platte mit klarem Boden in die Gewebekulturhaube und strahlen Sie sie 15 Minuten lang ohne Deckel ein.
    2. Entfernen Sie das Nährmedium aus den iPS-Zellen (siehe Materialtabelle) und waschen Sie die Vertiefungen mit PBS.
    3. In jede Vertiefung werden 0,5 ml vorgewärmtes, schonendes Zelldissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle) gegeben und 5 Minuten bei 37 °C inkubiert. Beobachten Sie die Zellen alle 5 Minuten, bis die iPS-Zellen zu Einzelzellen oder kleinen Aggregaten geworden sind, die in Suspension angehoben werden.
    4. Resuspendieren Sie die Zellsuspension mit einer 1-ml-Pipette, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
    5. Die Zellen werden bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
    6. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie ihn in IMDM-EB-Medien (Schritt 1.1.1) und zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Zellzähler.
    7. Berechnen Sie das geeignete Volumen der Zellsuspension, das erforderlich ist, um 5.000-25.000 Zellen pro Well der 384-Well-Platte mit 25 μl Zellsuspension pro Well zu erreichen.
      HINWEIS: Im Allgemeinen können 2-3 konfluente (70%-80%) Wells einer 6-Well-Platte EBs in einer 384-Well-Platte erzeugen. Die Größe der Zellen pro EB wird empirisch ermittelt. Für eine gesamte 384-Well-Platte müssen 9,6 ml Zellsuspension verwendet werden, 25 μl pro Well.
    8. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
    9. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen IMDM-EB-Medien und 10 μM Y-27632-Dihydrochlorid (Stamm: 10 mM, 1000x, siehe Materialtabelle) in einem vorgekühlten konischen 15-ml-Röhrchen.
    10. Kalt gelöste Basalmembranmatrix (1 mg pro 384-Well-Platte EBs) in die konische Matrix geben (siehe Materialtabelle).
    11. Verteilen Sie 25 μl der Zellsuspension auf jede Vertiefung. Einen sterilen Deckel auf die Platte legen und bei 450 x g bei 4 °C 7 min lang schleudern. 48 h bei 37 °C inkubieren.
    12. An Tag 2 werden die Zellen auf eine 100-mm-Platte mit 3 ml vorgewärmtem IMDM-EB-Medium übertragen.
    13. Überführen Sie die EBs in die speziellen polyHEMA-beschichteten T75-Kolben mit 10 ml IMDM-EB. Passen Sie das Volumen an die Größe des Kulturgefäßes an. Lassen Sie die EBs 3 Tage lang wachsen.
    14. Am 5. Tag werden die EBs in die vorbereiteten gelatinebeschichteten T75-Kolben mit 10 ml IMDM-EB-Medien überführt. Passen Sie das Volumen an die Größe des Kulturgefäßes an. Züchte die EBs für weitere 3 Tage in Suspension.
    15. Stellen Sie am 8. Tag sicher, dass zwei Arten von EBs beobachtet werden: EBs, die an den Kolben gebunden sind, und nicht gebundene EBs. Waschen Sie die nicht anhaftenden EBs mit PBS aus dem Kolben.
    16. Fügen Sie den beigefügten EBs IMDM-EB-Medien hinzu, die mit TGFβ-1 (10 ng/ml) (siehe Materialtabelle) ergänzt sind, und lassen Sie sie 2 Tage lang wachsen.
    17. Wechseln Sie an Tag 10 das Medium auf MSC-Medium. Die Zellen sollten zweimal pro Woche gefüttert werden. Sobald 70 % konfluent sind, fahren Sie mit dem "Standard-Hebezellenprotokoll" fort, um die Zellen neu zu beschichten. Die Zellen werden auf gelatinebeschichteten Platten neu beschichtet.
  3. Standardprotokoll für Hebezellen
    1. Sobald die adhärenten Zellen eine Konfluenz von 70 % erreicht haben, saugen Sie das Wachstumsmedium von den Platten ab und waschen Sie es mit PBS.
    2. Die Zellen werden angehoben, indem 5 ml vorgewärmtes 0,25%iges Trypsin auf jede 150-mm-Platte gegeben und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert werden. Passen Sie das Trypsinvolumen entsprechend der Größe des Kulturgefäßes an.
    3. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die meisten Zellen von jeder Platte abgehoben wurden. Wenn noch Zellen anhaften, klopfen Sie vorsichtig auf die Seiten der Platten, um die Zellen zu entfernen.
    4. Sammeln Sie die Zellen in einem konischen Röhrchen, indem Sie das doppelte Volumen des vorgewärmten Wachstumsmediums hinzufügen.
    5. Die Zellen werden bei Raumtemperatur für 5 min bei 300 x g zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und fahren Sie mit den nächsten Schritten fort.
  4. Durchflusszytometrische Beurteilung der MSC-Markerexpression
    HINWEIS: Humane MSCs, wie Knochenmark-MSCs, sollten als Positivkontrolle verwendet werden.
    1. Führen Sie das "Standard-Hebezellenprotokoll" durch (Schritt 1.3).
    2. Resuspendieren Sie den Überstand mit 3 ml FACS-Puffer und überführen Sie das gesamte Volumen in FACS-Röhrchen.
    3. Bei Raumtemperatur 5 min bei 300 x g zentrifugieren. Wiederholen Sie den Waschschritt mit FACS-Puffer noch zwei weitere Male.
    4. Zu den gefärbten Röhrchen werden 2 μl Maus-Antihuman-CD90-FITC, Maus-Antihuman-CD44-APC und Antihuman-CD105-PE (siehe Materialtabelle) zugegeben und 45 Minuten lang bei 4 °C inkubiert.
    5. Geben Sie 20 μl Maus-IgG2a-FITC, Maus-IgG1-PB und Maus-IgG1-PE in die Isotyp-Kontrollröhrchen (siehe Materialtabelle).
    6. Im Dunkeln bei 4 °C 15 min inkubieren. Waschen Sie alle Röhrchen, indem Sie 3 ml FACS-Puffer hinzufügen und 5 Minuten lang bei 300 x g (bei Raumtemperatur) zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 250 μl FACS-Puffer für jedes Röhrchen.
    7. Analyse der Expression der MSC-Oberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie14. Anregungs- und Emissionswellenlängen sollten sein: CD90-FITC, Anregungsspitze bei 495 nm und Emissionsspitze bei 519 nm; CD44-APC, Anregungsmaximum bei 640 nm und Emissionsmaximum bei 660 nm; CD105-PE, Anregungsmaximum bei 561 nm und Emissionsmaximum bei 574 nm.

2. iMSC-Passage und -Erweiterung

  1. Vorbereiten von Reagenzien
    1. Bereiten Sie MSC-Freeze-Medien vor.
      1. Kombinieren Sie 30 ml DMEM mit niedrigem Glukosegehalt, 5 ml DMSO und 15 ml FBS (Endkonzentrationen: 60 %, 10 %, 30 %).
      2. Die Lösung wird mit einem sterilen 0,45-μm-Filter filtriert. Bei 4 °C lagern.
  2. Passage
    HINWEIS: Nach der Induktion müssen iMSCs für weitere 2 Passagen auf gelatinebeschichteten Platten gezüchtet werden, bevor sie auf Kunststoffgewebekulturplatten entwöhnt werden. Darüber hinaus sollten die Zellen mit einem Teilungsverhältnis von 1:3 durchgelassen werden, wenn 70 % konfluent sind.
    1. Führen Sie das "Standard-Hebezellenprotokoll" durch (Schritt 1.3).
    2. Resuspendieren Sie die Zellen in MSC-Medien und verteilen Sie die Zellen gleichmäßig auf drei neue 150-mm-Platten mit T175-Kolben mit 20 ml Medien pro Kolben. Bringen Sie die Zellen wieder auf 37 °C.
    3. Füttern Sie die Zellen zweimal pro Woche, indem Sie das Wachstumsmedium durch vorgewärmte MSC-Medien ersetzen.
  3. Gefrieren
    1. Führen Sie das "Standard-Hebezellenprotokoll" durch.
    2. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml MSC-Gefriermedium. Geben Sie 1 ml Zellsuspension in ein Kryoröhrchen und lagern Sie es 24 Stunden lang in einem Gefrierbehälter bei -80 °C, bevor Sie es zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführen.
  4. Auftauen
    1. Bereiten Sie 10 ml vorgewärmtes MSC-Medium in einem konischen 15-ml-Röhrchen vor.
    2. Nehmen Sie das Kryoröhrchen heraus, tauchen Sie es in ein 37 °C heißes Wasserbad und schwenken Sie es, bis eine erbsengroße Eiskugel übrig bleibt (ca. 1-2 min).
    3. In der Zellkulturhaube langsam 1 ml des vorgewärmten Mediums in das Kryoröhrchen geben und zum Mischen auf und ab pipettieren.
    4. Die Zellsuspension wird aus dem Kryoröhrchen in das vorbereitete konische 15-ml-Röhrchen mit vorgewärmtem Medium überführt und 5 min bei 300 x g (bei Raumtemperatur) zentrifugiert.
    5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn mit frischem Medium. Geben Sie die Zellsuspension auf eine 150-mm-Platte mit einem Gesamtvolumen von 20 ml. Passen Sie das Volumen an die Größe des Kulturkolbens an.
    6. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, bis sie sich teilen können.

3. Gentechnik von iMSCs zur Überexpression von SCX mittels lentiviraler Transduktion

HINWEIS: Das Ausfüllen dieses Abschnitts des Protokolls dauert zwei Wochen.

  1. Vorbereitung von Medien und Reagenzien
    1. Bereiten Sie HEK293T/17-Zellmedien vor.
      1. Ergänzen Sie 445 ml Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) mit 50 ml FBS und 5 ml AAS (Endkonzentrationen: 10 %, 1 %).
    2. Bereiten Sie MSC-Lenti-Packmedien vor.
      1. Bereiten Sie das hitzeinaktivierte Serum vor, indem Sie 50 ml FBS bei Raumtemperatur in einem 60 °C warmen Wasserbad 30 Minuten lang erhitzen.
      2. Kombinieren Sie 445 ml DMEM mit niedrigem Glukosegehalt mit dem hitzeinaktivierten FBS und 5 ml L-Glutamin (Endkonzentrationen: 10 %, jeweils 2 mM).
    3. Bereiten Sie den Transfektionskomplex vor.
      1. Transfektionskomplexe Komponenten (siehe Materialtabelle) auf Eis auftauen lassen: Verpackungsplasmide VSV-G und Delta, SCX-Plasmid und BioT15,16.
      2. Wirbeln Sie die Plasmide sanft vor und drehen Sie sie herunter. Messen Sie die DNA-Konzentrationen.
      3. Berechnen Sie auf der Grundlage der DNA-Konzentrationen und der Anzahl der für die Transfektion vorgesehenen Kolben das Volumen jeder benötigten Komponente: Für einen T75-Kolben besteht der Transfektionskomplex aus 750 μl serumfreiem Medium (wie serumfreiem DMEM oder PBS), 7,5 μg SCX-Plasmid, 0,75 μg VSV-G-Plasmid, 6,75 μg Delta-Plasmid und 22,5 μl BioT. Berücksichtigen Sie einen zusätzlichen Pipettierfehler.
      4. Mischen Sie, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Kurz in einer Zentrifuge schleudern. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und sofort verbrauchen.
  2. Transfektion und lentivirale Produktion
    VORSICHT: Ab Tag 3 beinhaltet das Protokoll die Arbeit mit dem Lentivirus, und daher muss die Arbeit unter Verwendung von Betriebsverfahren der Eindämmungsstufe 2+ durchgeführt werden. Die Arbeiter müssen persönliche Schutzausrüstung tragen, darunter zwei Schichten Handschuhe, Handgelenksbedeckungen, Schutzbrillen, eine Maske sowie lange Hosen und geschlossene Schuhe. Alle Abfälle und Materialien, einschließlich Pipettenspitzen, Kolben und flüssiges Medium, müssen mindestens 20 Minuten lang mit Bleichmittel (1 % Natriumhypochlorit) dekontaminiert werden. Verwenden Sie den Staubsauger nicht.
    1. Aussaat HEK293T/17 Zellen.
      1. Etwa 18-24 Stunden vor der Transfektion (Tag 0) werden die 293T-Zellen in T75-Kolben gehoben und plattiert. In den folgenden Bänden wird T75 als Kulturgefäß angenommen. Passen Sie das Volumen entsprechend dem verwendeten Zellkulturgefäß an.
      2. Das Nährmedium aus den Kolben nehmen und mit 5 ml PBS waschen.
        HINWEIS: Die Zellen heben sich sehr leicht von der Oberfläche des Kolbens ab. PBS an den Rand des Kolbens geben und die direkte Zugabe von Lösung zu den Zellen vermeiden.
      3. In jeden Kolben werden 3 ml vorgewärmtes 0,25%iges Trypsin gegeben und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen werden in ein konisches Röhrchen gefüllt und bei Raumtemperatur 5 min bei 300 x g zentrifugiert.
      4. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie ihn in 293T-Medien und zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Zellzähler.
      5. Die Zellen werden mit 5,3 x 104 Zellen/cm2 plattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
      6. Am nächsten Tag (Tag 1) bereiten Sie den Transfektionskomplex vor. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium aus den Zellen durch 5 ml vorgewärmtes MSC-Lenti-Verpackungsmedium (Schritt 3.1.2).
      7. Geben Sie den Transfektionskomplex tropfenweise in die Zellen. Kippen Sie die Schale vorsichtig, um eine gleichmäßige Exposition des Transfektionskomplexes gegenüber den Zellen zu gewährleisten. Legen Sie die Zellen für 48 Stunden zurück in den Inkubator.
        HINWEIS: Die Toxizität sollte nach 24 Stunden (Tag 2) beobachtet werden.
      8. Nach 48 h (Tag 3) wird das virushaltige Medium vorsichtig mit einer Pipette in ein separates konisches Röhrchen aufgefangen und 5 min bei 300 x g (bei Raumtemperatur) zentrifugiert.
      9. 5 ml vorgewärmtes MSC-Lenti-Verpackungsmedium in den T75-Kolben mit 293T-Zellen geben und über Nacht in den Inkubator zurückgeben.
      10. Nach der Zentrifugation filtrieren Sie den Überstand mit einem 0,45 μm Sterilfilter, indem Sie den Überstand direkt durch den Filter pipettieren. Lagern Sie das virenhaltige Medium über Nacht bei 4 °C.
      11. Nach weiteren 24 h (Tag 4) wird das virushaltige Medium erneut vorsichtig mit einer Pipette in ein separates konisches Röhrchen aufgefangen und 5 min bei 300 x g (bei Raumtemperatur) zentrifugiert.
      12. Kombinieren Sie das Virus mit dem Virus vom vorherigen Abholtag und mischen Sie es, um eine homogene Lösung zu gewährleisten. An dieser Stelle kann das Protokoll je nach experimentellem Zeitplan pausiert und später neu gestartet werden. Das Lentivirus kann aliquotiert und bei -80 °C eingefroren werden, oder das Lentivirus kann auf Eis gelagert werden, während mit der "Transduktion von iMSCs mit SCX" (Schritt 3.3) fortgefahren wird.
        HINWEIS: Sobald die Lentivirus-Aliquots eingefroren und aufgetaut sind, nicht wieder einfrieren.
  3. Transduktion von iMSCs mit SCX
    1. Titerplattentransduktion durchführen.
      1. Führen Sie an Tag 0 das "Standard-Hebezellenprotokoll" durch.
      2. Resuspendieren Sie die Zellen in MSC-Medien und zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Zellzähler.
      3. In eine 6-Well-Platte 4 x 103 Zellen/cm2 geben. Den Rest in eine zusätzliche 150-mm-Platte mit 20 ml MSC-Medium eintragen (dies wird die Kontrollplatte sein). Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 °C.
      4. Am nächsten Tag (Tag 1) sollten die Zellen ~40% konfluent sein. Erwärmen Sie das Wachstumsmedium in der Lenti-Verpackung vor und tauen Sie das Polybrene und ca. 3 ml Lentivirus auf Eis auf Eis auf (oder, wenn dies am selben Tag wie die Virusentnahme geschieht, lagern Sie es bis zur Verwendung auf Eis).
      5. Geben Sie das Wachstumsmedium der Lenti-Verpackung und das Lentivirus basierend auf den gewünschten Titern (d. h. 12,5 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %) in die Vertiefungen. Fügen Sie 0,5 μl Polybrene hinzu, um eine Endkonzentration von 5 μg/ml zu erreichen (Stammkonzentration: 10 mg/ml, siehe Materialtabelle).
      6. Schwenken Sie die Platte, um eine gleichmäßige Exposition aller Zellen zu gewährleisten. Die Platte wird für 48 h bei 37 °C in den Inkubator zurückgelegt.
    2. Beurteilen Sie die Effizienz des SCX-Lentivirus-Titers mit Durchflusszytometrie.
      1. Führen Sie nach 48 Stunden das "Standard-Hebezellenprotokoll" durch.
      2. Resuspendieren Sie die Zellen im PBS und zählen Sie lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer oder Zellzähler. Die Zellen werden bei Raumtemperatur für 5 min bei 300 x g zentrifugiert.
      3. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn zum Waschen in 3 ml FACS-Puffer. Die Zellsuspension wird in Durchflusszytometrieröhrchen überführt und 5 min bei 300 x g zentrifugiert.
      4. Wiederholen Sie die FACS-Pufferwäsche noch zwei weitere Male und resuspendieren Sie die endgültigen Zellpellets in 300 μl FACS-Puffer. Beurteilen Sie die GFP-Expression für jeden Titer mit einem Durchflusszytometriegerät.
      5. Bestimmen Sie auf der Grundlage der Titer und der Anzahl der Zellviabilität den geeigneten Lentivirus-Titer, um mit der Transduktion fortzufahren. An dieser Stelle kann das Protokoll je nach experimentellem Zeitplan pausiert und später neu gestartet werden.
    3. Führen Sie eine groß angelegte SCX-Transduktion durch.
      HINWEIS: Die angegebenen Volumina gelten pro 1x 150 mm Platte oder 1x T175 Kolben. Dies kann je nach gewünschter Gefäßgröße und Transduktionsmaßstab entsprechend angepasst werden.
      1. Führen Sie an Tag 0 das "Standard-Hebezellenprotokoll" durch.
      2. Resuspendieren Sie die Zellen in MSC-Medien und zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Zellzähler. Säen Sie die Zellen mit 4 x 103 Zellen/cm2 aus. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 °C.
      3. Am nächsten Tag (Tag 1) sollten die Zellen ~40% konfluent sein. Erwärmen Sie das Wachstumsmedium in der Lenti-Verpackung vor und tauen Sie das Polybrene und die vorberechnete Menge des Lentivirus auf Eis auf.
      4. Basierend auf dem festgelegten Titer geben Sie die gewünschte Menge an Lenti-Verpackungsnährmedium und Lentivirus in die Vertiefungen. 5 μg/ml Polybrene (Stammkonzentration: 10 mg/ml) hinzufügen.
      5. An Tag 3 werden die Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Der neu hergestellte iMSCSCX+ soll GFP fluoreszieren. Ersetzen Sie das virushaltige Medium durch vorgewärmte MSC-Medien. An dieser Stelle kann das Protokoll je nach experimentellem Zeitplan pausiert und später neu gestartet werden.

4. iMSCSCX+ Passage und Erweiterung

  1. Führen Sie das Durchlassen, Expandieren, Einfrieren und Auftauen von iMSCSCX+ auf die gleiche Weise wie bei iMSCs durch, wie in Schritt 2 des Protokolls beschrieben.

5. Mechanische Belastung

HINWEIS: Dieser Abschnitt dauert mindestens 4 Tage, kann aber länger sein, je nachdem, ob eine Zellkontraktion beobachtet wird.

  1. Vorbereitung von Experimenten
    1. Bereiten Sie die Silikonplatten vor.
      1. Autoklaven Sie 2 Silikonplatten (siehe Materialtabelle). Entfernen Sie anschließend unter sterilen Bedingungen die Silikonplatten aus dem Autoklavenbeutel und legen Sie sie in 150-mm-Platten.
      2. Kombinieren Sie 130 μl Fibronektin (100x, siehe Materialtabelle) mit 13 ml sterilem PBS in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, um es zu mischen.
      3. Geben Sie 400 μl Fibronektinlösung in jede Vertiefung der Silikonplatten. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für mindestens 2 h oder über Nacht.
      4. Saugen Sie die Fibronektinlösung vor Gebrauch an und lassen Sie die Platten mindestens 30 Minuten lang in der Zellkulturhaube an der Luft trocknen, damit die Fibronektinlösung vollständig verdunsten kann.
        HINWEIS: Die Fibronektinlösung kann im Voraus aus den Vertiefungen entfernt werden, und die jetzt beschichteten Platten können bis zu ein paar Wochen bei 37 °C stehen, bis sie verwendet werden.
    2. Bereiten Sie die MSC-Stretchmedien vor.
      1. Bereiten Sie MSC-Stretchmedien vor, indem Sie 140 μl Ascorbinsäure (Stamm: 100x, Endkonzentration: 50 μg/ml) zu 14 ml vorgewärmtem MSC-Medium in einem konischen 15-ml-Röhrchen hinzufügen.
        HINWEIS: Die Ascorbinsäure muss vor jedem Medienwechsel frisch in das MSC-Medium gegeben werden.
  2. Aussaat von iMSCSCX+ in den Silikonplatten
    1. Führen Sie das "Standard-Hebezellenprotokoll" durch (Schritt 1.3).
    2. Resuspendieren Sie die Zellen in MSC-Medien und zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Zellzähler.
    3. Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, das erforderlich ist, um 1,25 x 104 Zellen/cm2 zu erhalten.
    4. Entfernen Sie dieses Volumen des MSC-Stretchmediums aus dem konischen 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie die Zielzellen hinzu. Invertieren Sie die neue Zellsuspension, um sie homogen zu machen.
    5. Geben Sie 400 μl der neuen Zellsuspension in jede Vertiefung beider Silikonplatten.
    6. Setzen Sie den Deckel wieder auf die 150-mm-Platten und legen Sie sie für 24 h bei 37 °C in den Inkubator.
  3. Einachsige Spannung
    1. Am nächsten Tag wird der Streckapparat (siehe Materialtabelle) mit ddH2O gefolgt von 70% Ethanol gespült. Wischen Sie das Gerät ab, legen Sie es in die Zellkulturhaube und setzen Sie es 15 Minuten lang UV ein.
    2. Holen Sie die ausgesäten Platten heraus und überprüfen Sie die Vertiefungen auf gute Zellhaftung.
    3. Lassen Sie eine Platte im Inkubator (statische Kontrolle) und legen Sie die zweitgesäte Silikonplatte in den Streckapparat, indem Sie die Schrauben an den Löchern in der Silikonplatte ausrichten. Setzen Sie den Deckel des Geräts wieder auf, um die Sterilität zu gewährleisten.
    4. Befestigen Sie das Gerät mit der beatmeten Silikonplatte an der elektronischen Quelle (siehe Materialtabelle) und stellen Sie es bei 37 °C in den Inkubator.
    5. Stellen Sie im Programm das zyklische Dehnungsprotokoll auf 4 % sinusförmige Dehnung, 0,5 Hz, 2 Stunden pro Tag ein. Beginnen Sie die Dehnung, indem Sie den Startknopf einmal drücken. Das Dehnen sollte sofort beginnen.
    6. Dehnen Sie die Zellen für mindestens 3 Tage. Überwachen Sie die Zellen täglich und stoppen Sie das Dehnungsprotokoll, wenn eine Zellkontraktion beobachtet werden kann. Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag zu neuen MSC-Stretchmedien.

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Ergebnisse

Humane iPS-Zellen Differenzierung zu iMSCs
Wie bereits beschrieben, beinhaltet das derzeitige Protokoll zur Differenzierung von iPS-Zellen in iMSCs die Bildung von Embryoidkörpern2. Dieser Prozess dauert etwa zehn Tage, um iMSCs aus iPS-Zellen zu induzieren (Abbildung 1A). Es wird jedoch dringend empfohlen, die neu generierten iMSCs mindestens zweimal zu passieren. Dies trägt nicht nur dazu bei, die Notwendigkeit von gelatinebeschichteten Platten...

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Diskussion

In diesem Protokoll werden iTenozyten durch drei Hauptschritte erzeugt: (1) Induktion von iPS-Zellen zu iMSCs, (2) Überexpression von SCX unter Verwendung eines lentiviralen Vektors und (3) Reifung von Zellen durch uniaxiale 2D-Spannung.

Das vorgestellte Protokoll zur Differenzierung von iPS-Zellen in iMSCs wurde bereits von unserer Gruppe2 beschrieben. Seit dieser Veröffentlichung wurden zahlreiche Protokolle entwickelt, darunter ein etabliertes Protokoll für die Ve...

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Offenlegungen

Alle Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde teilweise vom NIH/NIAMS-K01AR071512 und CIRM DISC0-14350 an Dmitriy Sheyn unterstützt. Die beiden Lentivirus-Verpackungsplasmide waren ein Geschenk des Simon-Knott-Labors (Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanol Sigma AldrichM3148
AccutaseStemCell Technologies7920cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solutionThermofisher15240096
Anti-CD105Ancell326-050
APC mouse anti-human CD44BD Biosciences559942
APC mouse IgG2 K isotype controlBD Biosciences555745
BenchMark fetal bovine serumGeminiBio100-106
BiglycanThermofisherHs00959143_m1
Bovine serum albuminMillipore SigmaA3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primerThermofisherHs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primerThermofisherHs00943809_m1
Dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol redThermofisher11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)ATCC30-2003
Fibronectin bovine plasmaSigma AldrichF1141
FITC mouse anti-human CD90BD Biosciences555595
Gelatin from porcine skinSigma AldrichG1890
Goat anti Mouse IgG1-PEBio-RadSTAR117
HEK 293T/17ATCCCRL-11268
IMDM, no phenol redThermofisher21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1Cedars-Sinai iPSC Core FacilityN/Ahttps://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITCMiltenyi Biotec130-113-271
KnockOut serum replacementThermofisher10828010
L-ascorbic acidSigma AldrichA4544
L-GlutamineThermofisher2503081
MatrigelCorning354230basement membrane matrix
MechanoCulture FXCellScaleN/Astretching apparatus
MEM non-essential amino acids solutionThermofisher11140050
Mohawk human Taqman primerThermofisherHs00543190_m1
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276
PBSThermofisher10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primerThermofisherHs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)Sigma Aldrich192066
Polybrene infection/transfection reagentsMillipore SigmaTR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primerRnD Systems240-B
Scleraxis human Taqman primerThermofisherHs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF cloneOriGeneRC224305L4
Silicone platesCellScaleN/A
Sodium azideMillipore SigmaS2002
Tenascin C human Taqman primerThermofisherHs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primerThermofisherHs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primerThermofisherHs00170261_m1
Transfection reagent, BioTBioland Scientific LLCB01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermofisher25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3ThermofisherHs03043892_m1
Y-27632 dihydrochlorideBiogems1293823

Referenzen

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