Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung enzymatisch dissoziierter Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Muskeln erwachsener Mäuse: drei davon bereits beschrieben (Flexor digitorum brevis, Extensor digitorum longus, soleus) und drei von ihnen erstmals erfolgreich dissoziiert (Extensor hallucis longus, Peroneus longus, Peroneus digiti quarti).

Zusammenfassung

Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von Mausmuskeln gewonnen werden, sind ein nützliches Modell für physiologische Experimente. Die meisten Arbeiten befassen sich jedoch mit den kurzen Fasern des Flexor digitorum brevis (FDB), was den Umfang der Ergebnisse einschränkt, die sich mit Fasertypen befassen, die Menge des verfügbaren biologischen Materials begrenzt und eine klare Verbindung zwischen zellphysiologischen Phänomenen und früheren biochemischen und dynamischen Erkenntnissen in anderen Muskeln verhindert.

In diesem Artikel wird beschrieben, wie intakte Fasern aus sechs Muskeln mit unterschiedlichen Fasertypprofilen und -längen gewonnen werden können. Anhand von erwachsenen C57BL/6-Mäusen zeigen wir das Muskeldissektions- und Faserisolationsprotokoll und demonstrieren die Eignung der Fasern für Ca²⁺ transiente Studien und ihre morphometrische Charakterisierung. Die faserartige Zusammensetzung der Muskeln wird ebenfalls vorgestellt. Bei der Dissoziation wurden alle Muskeln intakte, lebende Fasern, die sich länger als 24 Stunden schnell zusammenzogen. FDB ergab kurze (<1 mm), Peroneus digiti quarti (PDQA) und Peroneus longus (PL) ergaben intermediäre (1-3 mm), während Extensor digitorum longus (EDL), Extensor hallucis longus (EHL) und Soleus-Muskeln lange (3-6 mm) Fasern freisetzten.

Bei der Aufzeichnung mit dem schnellen Farbstoff Mag-Fluo-4 zeigten Ca2⁺ -Transienten von PDQA-, PL- und EHL-Fasern eine schnelle, schmale Kinetik, die an die Morphologie des Typs II (MT-II) erinnert, von der bekannt ist, dass sie den Fasern vom Typ IIX und IIB entspricht. Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass diese Muskeln über 90% Typ-II-Fasern aufweisen, verglichen mit FDB (~80%) und Soleus (~65%). Über FDB hinaus zeigen wir zum ersten Mal die Dissoziation mehrerer Muskeln, die Fasern ergeben, die einen Längenbereich zwischen 1 und 6 mm umfassen. Diese Fasern sind lebensfähig und liefern schnelle Ca2⁺ -Transienten, was darauf hindeutet, dass das MT-II unabhängig von ihrer Muskelquelle auf IIX- und IIB-Fast-Fasern verallgemeinert werden kann. Diese Ergebnisse erhöhen die Verfügbarkeit von Modellen für Studien zur reifen Skelettmuskulatur.

Einleitung

Der reife Skelettmuskel von Säugetieren ist ein multifunktionales Gewebe. Es reguliert den Stoffwechsel stark, ist die Hauptquelle der Wärmeerzeugung und seine dynamischen Eigenschaften verleihen ihm eine Schlüsselrolle bei der Atmung, der Bewegung von Körpersegmenten oder der Verschiebung von einem Punkt zum anderen ^1,2,3. Die Skelettmuskulatur ist auch für die Pathophysiologie vieler Krankheiten relevant, einschließlich erblicher und chronischer Erkrankungen wie Myopathien, Dystrophien oder Sarkopenie sowie vieler chronischer Erkrankungen außerhalb des Muskels, wie z. B. ka....

Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Kommission für Ethik bei Tierversuchen der Universität von Antioquia (UdeA) (Protokoll 104 vom 21^. Juni 2016 und 005 vom 15^. April 2021) gemäß dem Gesetz 84 von 1989 und der Resolution 8430 von 1993 der kolumbianischen Regierung genehmigt und in Übereinstimmung mit den Tierversuchen durchgeführt und gemeldet: Richtlinien für die Berichterstattung über In-vivo-Experimente (ARRIVE)⁴¹. Alle hier vorgestellten Ergebnisse stammen von gesunden, 7-13 Wochen alten, 20-26 g schweren, männlichen C57BL/6-Mäusen. Abbildung 1 zeigt den allgemeinen Aufbau dieser Stud....

Diskussion

Als Ergänzung zu den Modellen, die für die Untersuchung der Biologie der reifen Skelettmuskulatur zur Verfügung stehen, zeigen wir hier die erfolgreiche enzymatische Dissoziation einer Reihe von Mausmuskeln mit kurzen, mittleren und langen Fasern. Diese Fasern ermöglichen den Nachweis der Generalisierbarkeit der MT-II-Kinetik der Ca²⁺ -Transienten im Skelettmuskel. Weiterhin wurden die Fasertypen in den intakten, ganzen Muskeln klassifiziert. Da der FDB der am häufigsten verwendete Muskel für physiologis.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Absolute ethanol	Sigma Aldrich	32221
Acetone	Merck	179124
Acrylamide	Gibco BRL	15512-015
Ammonium persulfate	Panreac	141138.1610
Anti myosin I antibody	Sigma Aldrich	M4276	Primary antibody
Anti myosin II antibody	Sigma Aldrich	M8421	Primary antibody
Anti myosin IIA antibody	American Type Culture Collection	SC-71	Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	BF-F3-c	Primary antibody
Bis-acrylamide	AMRESCO	0172
Bovine serum albumin	Thermo Scientific	B14
Bradford reagent	Merck	1.10306.0500
Bromophenol blue	Carlo Erba	428658
Calcium carbonate	Merck	102066
Calcium dichloride (CaCl2)	Merck	2389
Chloroform	Sigma Aldrich	319988
Collagenase type 2	Worthington	CLS-2/LS004176
Consul-Mount	Thermo Scientific	9990440
Coomassie Brilliant blue R 250	Merck	112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dithiothreitol (DTT)	AMRESCO	0281
Edetic acid (EDTA	AMRESCO	0322
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
Glycerol	Panreac	1423291211
Glycine	Panreac	151340.1067
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Hematoxylin	Thermo Scientific	6765015
HEPES	AMRESCO	0511
Hoechst 33258	Sigma Aldrich	861405
Imidazole	AMRESCO	M136
Isopentane	Sigma Aldrich	M32631
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Mag-Fluo-4, AM	Invitrogen	M14206	Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol	Applichem	A11080100
Methanol	Protokimica	MP10043
Mice	Several	Several	For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)	Promega	V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Tocris	1870
Optimal cutting compound (OCT)	Thermo Scientific	6769006
Secondary antibody	Thermo Scientific	A-11001	Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate	Panreac	1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8	AMRESCO	J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane	AMRESCO	M151
Triton X-100	AMRESCO	M143
Materials
Dissection chamber	Custom-made
Charged slides	Erie Scientific	5951PLUS
Experimental bath chamber	Warner Instruments	RC-27NE2	Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps	World Precision Instruments	500338, 500230
Fine scissors	World Precision Instruments	Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes	Several		Fire-polished tips
Glass vials with cap	Several		2-3 mL volumen
Operating scissors	World Precision Instruments	501223-G
Equipment
Centrifuge	Thermo Scientific	SL 8R
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Cryostat	Leica	CM1850
Digital camera	Zeiss	Erc 5s and Axio 305	Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer	Molecular Devices	1550A Digidata
Electrophoresis chamber	Bio Rad	Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence	Zeiss	Axio Observer A1	Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier	Horiba	R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba	Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope	Zeiss	Stemi 508
Stimulator	Grass Instruments	S6
Water bath	Memmert	WNE-22
Xilol	Sigma Aldrich	808691
Software
Free software for electrophoreses analyses	University of Kentucky	GelBandFitter v1.7	http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry	National Institutes of Health	ImageJ v1.54	https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses	Molecular Devices	pCLAMP v10.05	https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing	OriginLab	OriginPro 2019	https://www.originlab.com/