Kosteneffizientes transkriptomisches Wirkstoff-Screening

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen Arbeitsablauf von Ex-vivo - oder In-vitro-Zellkulturen bis hin zur transkriptomischen Datenvorverarbeitung für ein kostengünstiges Transkriptom-basiertes Wirkstoff-Screening.

Zusammenfassung

Die Transkriptomik ermöglicht es, umfassende Einblicke in zelluläre Programme und deren Reaktionen auf Störungen zu erhalten. Obwohl die Kosten für die Herstellung und Sequenzierung von Bibliotheken in den letzten zehn Jahren erheblich gesunken sind, ist die Anwendung dieser Technologien in dem für das Drogenscreening erforderlichen Umfang nach wie vor unerschwinglich teuer, was das immense Potenzial dieser Methoden behindert. Unsere Studie stellt ein kostengünstiges System für das Transkriptom-basierte Wirkstoff-Screening vor, das miniaturisierte Störungskulturen mit Mini-Bulk-Transkriptomik kombiniert. Das optimierte Mini-Bulk-Protokoll liefert informative biologische Signale in kostengünstiger Sequenzierungstiefe und ermöglicht so ein umfangreiches Screening bekannter Wirkstoffe und neuer Moleküle. Abhängig von der gewählten Behandlung und der Inkubationszeit führt dieses Protokoll innerhalb von ca. 2 Tagen zur Sequenzierung von Bibliotheken. Durch mehrere Haltepunkte innerhalb dieses Protokolls kann sowohl die Bibliotheksvorbereitung als auch die Sequenzierung zeitunabhängig durchgeführt werden. Die gleichzeitige Verarbeitung einer hohen Anzahl von Proben ist möglich; Die Messung von bis zu 384 Proben wurde ohne Verlust der Datenqualität getestet. Es gibt auch keine bekannten Beschränkungen für die Anzahl der Erkrankungen und/oder Medikamente, trotz der Berücksichtigung der Variabilität der optimalen Inkubationszeiten von Arzneimitteln.

Einleitung

Die Entwicklung neuer Arzneimittel ist ein komplexer und zeitaufwändiger Prozess, der die Identifizierung potenzieller Arzneimittel und ihrer Ziele, die Optimierung und Synthese von Arzneimittelkandidaten sowie die Prüfung ihrer Wirksamkeit und Sicherheit in präklinischen und klinischen Studien umfasst¹. Traditionelle Methoden für das Wirkstoff-Screening, d. h. die systematische Bewertung von Bibliotheken von Wirkstoffkandidaten für therapeutische Zwecke, beinhalten die Verwendung von Tiermodellen oder zellbasierten Assays, um die Auswirkungen auf bestimmte Ziele oder Signalwege zu testen. Diese Methoden waren zwar erfolgreich bei der Identifiz....

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der lokalen Ethikkommissionen der Universität Bonn.

1. Vorbereitung von Puffern, Lösungen und Geräten

1. Bereiten Sie die Lösungen vor und sammeln Sie die Materialien, die in der Materialtabelle beschrieben sind.
2. Das Wasserbad auf 37 °C erhitzen und das komplette Wachstumsmedium erwärmen (RPMI-1640 + 10 % fötales Kälberserum (FCS) + 1 % Penicillin/Streptomycin).
3. Verwenden Sie für die Zellernte eiskalte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
   HINWEIS: Sorgen Sie für eine saubere Umgebung, während Sie mit Zellen arbeiten, um die Sterilität....

Diskussion

Die Arzneimittelforschung und -entwicklung kann stark von der ganzheitlichen Sicht auf zelluläre Prozesse profitieren, die die Bulk-Transkriptomik bieten kann. Dieser Ansatz wird jedoch oft durch die hohen Kosten des Experiments mit dem Standard-Bulk-RNA-seq-Protokoll eingeschränkt, was seine Anwendung im akademischen Umfeld sowie sein Potenzial für industrielle Skalierbarkeit verbietet.

Die kritischsten Schritte des Protokolls sind das Auftauen der Zellen und die ersten Schritte der Biblio.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tube	fisher scientific	10203001
Adhesive PCR Plate Seals	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A 63881
Betaine	Sigma-Aldrich	61962
Cell culture grade 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	for adherent cells
Ethanol	Sigma-Aldrich	51976
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Filter tips (10 µL)	Gilson	F171203
Filter tips (100 µL)	Gilson	F171403
Filter tips (20 µL)	Gilson	F171303
Filter tips (200 µL)	Gilson	F171503
Guanidine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR primer (10 µM)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Magnetic stand 96	Ambion	AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer	Illumina
Nuclease-free water	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB0600
PCR plate sealer	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Penicillin / Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 fluorometer	Invitrogen	15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 cell culture medium	Gibco	61870036	If not working with PBMCs, adjust to cell type
SMART dT30VN primer	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Standard lab equipment	various	various	e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer	Sigma-Aldrich	Z258415