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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Induktion von H-Typ-Hypertonie vor und bewerten die blutdrucksenkende Wirkung der intragastrisch verabreichten Huotan Jiedu Tongluo-Abkochung (HTJDTLD). Bei Ratten mit H-Typ-Hypertonie hatte HTJDTLD eine wirksame blutdrucksenkende Wirkung, die möglicherweise mit einer Hemmung der stressinduzierten Apoptose-Aktivierung des endoplasmatischen Retikulums (ER) verbunden war.

Zusammenfassung

Die H-Typ-Hypertonie, eine spezifische Form der Hypertonie, die durch erhöhte Homocysteinspiegel (Hcy) im Plasma gekennzeichnet ist, ist weltweit zu einer großen Herausforderung für die öffentliche Gesundheit geworden. Diese Studie untersuchte die blutdrucksenkende Wirkung und die zugrunde liegenden Mechanismen der Huotan Jiedu Tongluo-Abkochung (HTJDTLD), einer hochwirksamen Formel der traditionellen chinesischen Medizin, die häufig zur Behandlung von Gefäßstenose eingesetzt wird. Methionin wurde verwendet, um H-Typ-Hypertonie bei Ratten zu induzieren, und HTJDTLD wurde intragastrisch verabreicht. Anschließend wurden der systolische und diastolische Blutdruck der Schwanzarterie von Ratten durch nichtinvasive kaudale Manometrie der Ratte gemessen. Die histologische Beurteilung der Aorta erfolgte durch Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung. Zur Messung des Hcy-Spiegels wurde ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) verwendet, und zur Bestimmung der mRNA- und Proteinspiegel des Glukose-regulatorischen Proteins 78 (GRP78), des Tumornekrosefaktors (TNF)-Rezeptor-assoziierten Faktors 2 (TRAF2), der c-Jun N-terminalen Kinasen (JNK) und Caspase-3 wurden die quantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Polymerase-Kettenreaktionen (qRT-PCR) und Western Blotting verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass HTJDTLD nach der Behandlung mit Methionin den Blutdruck signifikant senkte, histopathologische Läsionen linderte und die Hcy-Spiegel senkte. Darüber hinaus hemmte HTJDTLD signifikant die Gen- und Proteinexpression von GRP78, JNK, TRAF2 und Caspase 3, die hauptsächlich am Stress-induzierten Apoptoseweg des endoplasmatischen Retikulums (ER) beteiligt sind. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass HTJDTLD bei Ratten mit H-Typ-Hypertonie wirksame blutdrucksenkende Wirkungen hatte und die blutdrucksenkenden Mechanismen aufzeigten, die mit der Hemmung der Aktivierung des ER-Stress-induzierten Apoptosewegs verbunden sind.

Einleitung

Bluthochdruck, ein Hauptrisikofaktor für Herzinfarkt, Schlaganfall und Nierenversagen, ist zu einer bedeutenden Herausforderung für die öffentliche Gesundheit geworden, von der weltweit 1 Milliarde Menschen betroffensind 1. Homocystein (Hcy), eine Thiolgruppe enthaltende Aminosäure, ist ein wichtiger Stoffwechselvermittler des Methioninstoffwechsels. Hypertonie mit erhöhten Hcy-Spiegeln im Plasma wird als H-Typ-Hypertonie definiert, die ein signifikanter Risikofaktor für das Auftreten und Wiederauftreten von kardiozerebrovaskulären Erkrankungen wie Schlaganfall sein könnte 2,3. Jüngste Studien haben berichtet, dass die gleichzeitige Residenz von H-Typ-Hypertonie die Nebenwirkungen von Herz-Kreislauf- und zerebrovaskulären Erkrankungen verschlimmern kann4. Bemerkenswert ist, dass 75 % der Patienten in China mit H-Typ-Hypertonie an primärer Hypertonie leiden, die die Lebensqualität ernsthaft beeinträchtigt5. Derzeit umfasst die Behandlung der Hypertonie vom H-Typ hauptsächlich die westliche Medizin. Es kann jedoch bestimmte Nebenwirkungen und eine schlechte Compliance verursachen und kann die Anforderungen an eine umfassende Behandlung der H-Typ-Hypertonie nicht mehr erfüllen.

Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) ist eine einzigartige Ressource mit einer mehr als 2.000-jährigen Geschichte in China. Aufgrund des ungedeckten Bedarfs an Bluthochdruckkontrolle in der westlichen Medizin haben Kliniker begonnen, die mögliche Rolle der TCM bei der Prävention und Behandlung von H-Typ-Hypertonie in Betracht zu ziehen6. Huotan Jiedu Tongluo Decoction (HTJDTLD) ist eine Formel der traditionellen chinesischen Medizin, die von Professor Yue Deng formuliert wurde und sich auf seine umfangreiche klinische Expertise stützt7. Im Laufe von mehr als 20 Jahren klinischer Anwendung hat HTJDTLD eine bemerkenswerte Wirksamkeit bei der Behandlung von Herz-Kreislauf- und zerebrovaskulären Erkrankungen gezeigt1. Es wurde jedoch nicht berichtet, ob HTJDTLD therapeutische Wirkungen bei H-Typ-Hypertonie hat. Daher haben wir uns zum Ziel gesetzt, die blutdrucksenkende Wirkung und die spezifischen Mechanismen von HTJDTLD bei Ratten mit H-Typ-Hypertonie zu untersuchen und potenzielle therapeutische Medikamente zur Behandlung von H-Typ-Hypertonie zu identifizieren.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Changchun University of Chinese Medicine genehmigt. Die Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Tiere und Behandlung

  1. Teilen Sie nach dem Zufallsprinzip insgesamt 50 erwachsene spontan hypertensive Ratten (SHRs) (männlich, 50 Tage alt) in fünf Gruppen ein, darunter Kontrollgruppen (CON), Methionin (MET), MET + HTJDTLD + Enalaprilmaleat (EM), MET + EM und MET + HTJDTLD.
    HINWEIS: Die Versuchsratten wurden in einer kontrollierten Umgebung untergebracht, die ihren Komfort und ihr Wohlbefinden gewährleisten sollte. Die Anlage verfügte über klimatisierte Räume mit einer konstanten Temperatur von 22 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40-60 %. Die Käfige wurden aus transparentem Polycarbonat gefertigt und boten jeder Ratte ausreichend Platz, um sich frei zu bewegen. Der Beleuchtungsplan folgte einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus, der natürliche Tageslichtverhältnisse simulierte. Die Ratten wurden mit ausreichend Futter und Wasser versorgt.
  2. Geben Sie den Ratten 28 Tage lang die folgende Diät.
    1. Geben Sie den Ratten in der MET-Gruppe 28 Tage lang eine 3%ige Methionin-Diät, um eine Hypertonie vom H-Typ zu induzieren.
    2. Verabreichen Sie den Ratten in der MET + HTJDTLD + EM-Gruppe intragastrisch mit HTJDTLD (1,633 g/ml) und EM (0,2 mg/ml) in einer Dosis von 1 ml/kg, wenn die Ratten zusätzlich zur 3%igen Methionin-Diät.
    3. Verabreichen Sie den Ratten in den Gruppen MET +EM und MET + HTJDTLD zusätzlich zur 3%igen Methionin-Diät HTJDTLD bzw. EM per Sonde.
      HINWEIS: Das HTJDTLD besteht aus Fructus Trichosanthis (20 g), Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae (15 g), Lonicerae japonicae flos (30 g), Radix et Rhizoma Nardostachyos (15 g), Radix Angelicae sinensis (15 g), Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (10 g), Hirudo (5 g), Radix et Rhizoma Rhodiolae crenulatae (15 g) und Radix Scrophulariae (15 g) und wurde wie zuvor berichtet dekoktiert7. EM gelöst in gereinigtem Wasser (0,2 mg/ml) diente als Positivkontrolle.

2. Blutdruckmessung

HINWEIS: Die Blutdruckmessungen werden mit einem nichtinvasiven Blutdruckmessgerät durchgeführt (Materialtabelle).

  1. Nach 28-tägiger Behandlung fasten die Ratten in jeder Gruppe 12 Stunden lang und messen Sie den Blutdruck.
  2. Wählen Sie eine Rückhaltevorrichtung, die der Größe der Ratte entspricht. Die in dieser Studie verwendete Rückhaltevorrichtung umfasst ein zylindrisches Rückhaltenetz, eine Leinwandabdeckung, ein Thermorohr und ein stabilisierendes Schaumstoffpolster. Legen Sie die Ratte in das Rückhaltenetz, legen Sie das Rückhaltenetz in das Thermorohr und setzen Sie dann das Thermorohr in die Plane ein.
  3. Legen Sie das Signalkabel an einer geeigneten Stelle unter die Abdeckung. Legen Sie den Rattenschwanz in die dafür vorgesehene Lücke in der Abdeckung und befestigen Sie ihn auf dem stabilisierenden Formpolster. Für Messungen wird eine unbesetzte, ruhige und warme Umgebung bevorzugt. Bringen Sie die Ratten 20-30 Minuten vorher zum Messort, damit sich die Ratten an die Messumgebung anpassen können.
    HINWEIS: Die Schritte 2.2-2.3 können mehrmals durchgeführt werden, um die Ratten zu stabilisieren. Nach mehreren Trainingseinheiten werden sich die Ratten daran gewöhnen und können sich sehr schnell stabilisieren, was für die anschließende Blutdruckmessung praktisch ist.
  4. Schließen Sie den Luftschlauchanschluss, den Signalanschluss und das Halterohr des Drucksensors an. Platzieren Sie den Drucksensor an der Spitze des Hecks.
  5. Messen Sie den Blutdruck. Eine Pulswelle erscheint, nachdem der Rattenschwanz in den Sensor eingeführt wurde. Drücken Sie Start/Stopp , um die Messung zu starten/stoppen.
    HINWEIS: Das Gerät ermittelt automatisch, ob der Schwanz der Ratte in den Sensor eingeführt wurde. Wenn der Schwanz der Ratte nicht eingeführt ist, beginnt der Druckbeaufschlagungssensor nicht mit der Druckbeaufschlagung und führt die Messung nicht durch.
  6. Wenn der Blutdrucktest abgeschlossen ist, wird das Menü "Ergebnis" automatisch angezeigt. Überprüfen Sie den Durchschnittswert der Messung, die Standardabweichung (SD), den Standardfehler (SE) und den Variationskoeffizienten (CV) im Menü Ergebnisse .
    HINWEIS: Der Blutdruck jeder Ratte wurde dreimal im Abstand von mehr als 2 Minuten gemessen und der Mittelwert berechnet.
  7. Nach der Messung des Blutdrucks wird die Ratte durch intraperitoneale Injektion von überschüssigem 2%igem Natrium-Pentobarbital (100 mg/kg) eingeschläfert. Anschließend präparieren Sie die Ratte mit einer chirurgischen Schere und einer Zahnzange Schicht für Schicht vom Damm bis zum Hals. Drehen Sie den thorakalen und abdominalen Inhalt um, navigieren Sie zur Bauchaortengabelung zwischen den beiden Nieren und sammeln Sie die Aorta bis zu einem Abschnitt des Aortenbogens.

3. Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung

  1. Fixieren Sie das Aortengefäßgewebe für mindestens 24 h in 4% Paraformaldehyd.
  2. Nehmen Sie die Gefäßproben, entwässern Sie sie in Gradientenalkohol, machen Sie sie in Xylol transparent und betten Sie sie in Paraffin ein.
  3. Machen Sie nach dem Einbetten durchgehende Scheiben mit einer Dicke von 3-5 mm. Die Scheiben bei 60-70 °C trocknen und anschließend bei Raumtemperatur (RT) lagern.
  4. Entparaffinieren Sie die Abschnitte, indem Sie die Abschnitte 30 min lang in Xylol I, 30 min in Xylol II, 100 % Alkohol I für 10 min, 100 % Alkohol II für 10 min, 95 % Alkohol I für 5 min, 95 % Alkohol II für 5 min, 80 % Alkohol für 5 min eintauchen und dann mit destilliertem Wasser abspülen.
  5. Färben Sie die Abschnitte 5 Minuten lang mit Harris-Hämatoxylin und spülen Sie sie 5 Minuten lang mit Leitungswasser ab. 10 s in 1%igem Salzsäurealkohol differenzieren und 15 min gründlich in Leitungswasser spülen. Waschen Sie die Sektion 5 s lang in Ammoniakwasser und spülen Sie sie 15 Minuten lang gründlich mit Leitungswasser ab.
  6. Führen Sie eine mikroskopische Betrachtung durch, färben Sie sie 10 Minuten lang mit Eosin und spülen Sie sie 15 Minuten lang gründlich mit Leitungswasser ab.
  7. Dehydrieren Sie die Schnitte, indem Sie sie 10 s lang in 80 % Ethylalkohol, 5 min lang 95 % Alkohol I, 5 min lang 95 % Alkohol II, 100 % Alkohol I 10 min, 100 % Alkohol II 10 min, 10 min lang Xylol I und 10 min lang Xylol II eintauchen.
  8. Versiegeln Sie die Abschnitte mit neutralem Gummi.
  9. Beobachten Sie die histologischen Veränderungen im Aortengewebe unter einem Lichtmikroskop (100-faches Objektiv, 1000-fache Vergrößerung).

4. Massons Trichrom-Färbung

  1. Führen Sie eine routinemäßige Entparaffinierung durch, die der HE-Färbung ähnelt.
  2. Hämatoxylin-Färbung: Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in Hämatoxylinlösung und spülen Sie sie dann sofort mit Leitungswasser ab.
  3. Tauchen Sie die Objektträger einige Sekunden lang in 1%ige Salzsäurelösung und spülen Sie sie anschließend sofort mit Leitungswasser ab.
  4. Tauchen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in Lichtenstein acidic magenta stain und spülen Sie sie dann mit Wasser ab.
  5. Tauchen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in 1% Phosphomolybdsäure.
  6. Tauchen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in 2 % Anilinblau-Färbung und 1 Minute in 1 % Eisessig-Tauchwaschlösung. Waschen Sie die Objektträger dann 3 Mal schnell in 95% Alkohol.
  7. Führen Sie routinemäßige Dehydratisierung, Transparenz und neutrale Zahnfleischversiegelung durch, ähnlich wie bei HE-Färbungen.

5. Hcy-Messung mittels ELISA

  1. Betäuben Sie die Ratten durch intraperitoneale Injektion von 2% Pentobarbital-Natrium (45 mg/kg) und bestätigen Sie die Narkosetiefe durch ein Zehenkneifen. Halten Sie die Ratte fest und schneiden Sie die Schnurrhaare ab, um einen Kontakt bei der Blutentnahme zu vermeiden. Entfernen Sie die Augäpfel der Ratte mit einer gebogenen Pinzette und sammeln Sie das Blut in den vorbereiteten sterilen Mikrozentrifugenröhrchen. Und dann euthanasieren Sie die Ratte mit einer intraperitonealen Injektion von überschüssigem 2% Natrium-Pentobarbital (100 mg/kg).
  2. Lassen Sie das Blut 10-20 Minuten lang bei RT auf natürliche Weise gerinnen und zentrifugieren Sie das Blut dann etwa 20 Minuten lang bei 2-8 °C (626-1409 x g).
  3. Den Überstand vorsichtig auffangen und im Kühlschrank bei -80 °C lagern.
  4. Verdünnen Sie den Standard im Reagenzglas gemäß den Anweisungen des Kits.
  5. Richten Sie leere Vertiefungen ein (es werden keine Proben und Enzymreagenzien zu den blinden Kontrollvertiefungen hinzugefügt; der Rest der Schritte ist identisch), Standardvertiefungen und Probenvertiefungen, die getestet werden sollen. Geben Sie 50 μl Standards in die Platte, 40 μl Probenverdünnungslösung in die Probenvertiefungen und dann 10 μl Serum (die endgültige Verdünnung der Probe beträgt das 5-fache).
    HINWEIS: Geben Sie die Probe auf den Boden der Vertiefungen der Platte; Versuchen Sie, die Wände der Vertiefungen nicht zu berühren, und schütteln Sie sie leicht, um sich zu vermischen.
  6. Die Platte mit Siegelfolie verschließen und bei 37 °C 30 min inkubieren.
  7. Die 30-fach konzentrierte Waschlösung 30-mal mit destilliertem Wasser verdünnen und für den Gebrauch vorbereiten.
  8. Entfernen Sie vorsichtig die Siegelfolie, entsorgen Sie die Flüssigkeit und schütteln Sie sie, um die gesamte Flüssigkeit zu entfernen. Füllen Sie jede Vertiefung mit Waschlösung, lassen Sie sie 30 s einwirken und entsorgen Sie sie. Wiederholen Sie dies 5 Mal und klopfen Sie es trocken.
  9. Geben Sie 50 μl Enzymreagenz in jede Vertiefung, mit Ausnahme der Blindvertiefungen.
  10. Die Platte mit einer Siegelfolie verschließen und anschließend bei 37 °C 30 min inkubieren.
  11. Wiederholen Sie Schritt 5.8.
  12. Geben Sie 50 μl Farbentwickler A in jede Vertiefung, fügen Sie dann 50 μl Farbentwickler B hinzu und schütteln Sie es vorsichtig, um es gut zu vermischen. Bei 37 °C 10 min bei schwachem Licht inkubieren.
  13. Geben Sie 50 μl der Stopplösung in jede Vertiefung, um die Reaktion zu beenden (die blaue Farbe wird gelb).
  14. Nullen Sie die Reaktion mit Blindvertiefungen und messen Sie die Absorption (OD-Wert) jeder Vertiefung nacheinander bei 450 nm.
    HINWEIS: Die Messung sollte innerhalb von 15 Minuten nach Zugabe der Stopplösung durchgeführt werden.

6. RNA-Extraktion und quantitative RT-PCR

  1. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA.
    1. Schneiden Sie das frische Aortengewebe schnell auf die entsprechende Größe (30-50 mg/Stück) und mahlen Sie es gründlich in flüssigem Stickstoff. Fügen Sie 1 ml Trizol-Reagenz hinzu, mischen Sie gut und inkubieren Sie es 10 Minuten lang auf Eis, um das Gewebe zu lysieren.
    2. Zentrifugieren bei 2250 x g für 10 min bei 4 °C. Den Überstand vorsichtig ohne Pellets in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen.
    3. 200 μl Chloroform zugeben, 15 s kräftig schütteln und 5 min bei RT inkubieren.
    4. Zentrifugieren Sie bei 2250 x g für 15 min bei 4 °C. Das Gemisch wird in drei Schichten unterteilt: die untere organische Phenol-Chloroform-Phase, die mittlere Phase und die obere wässrige Phase.
    5. Die obere wässrige Phase wird vorsichtig in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen (ca. 60 Vol.-% Trizol) überführt. Die Zwischenphase nicht ansaugen; Eine kleine Menge der oberen Flüssigkeit kann übrig bleiben.
    6. Fügen Sie ein gleiches Volumen Isopropanol hinzu, mischen Sie vorsichtig, indem Sie es etwa 10 Mal invertieren, und lassen Sie es 10 Minuten bei RT einwirken.
    7. Zentrifugieren bei 2250 x g für 10 min bei 4 °C. Den Überstand verwerfen und den RNA-Präzipitat zweimal mit 1 ml 75%igem Ethanol waschen.
    8. Bei 2250 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand verwerfen und 5-10 min bei RT an der Luft trocknen.
    9. Lösen Sie RNA in 15-50 μl Diethylpyrocarbonat (DEPC) Wasser auf und überprüfen Sie die RNA-Konzentration.
  2. Durchführung von reverser Transkription und RT-qPCR (Tabelle 1)
    1. Nachweis der Genexpression im Zusammenhang mit endoplasmatischem Retikulumstress (ERS) und Apoptose mittels qRT-PCR. Verwenden Sie die in Schritt 6.1 extrahierte Gesamt-RNA und transkribieren Sie sie mit dem cDNA-Synthesekit gemäß den Anweisungen des Herstellers in cDNA.
    2. Bestimmen Sie die Genexpression mit einem Real-Time-PCR-Nachweissystem mit einem SYBR Green PCR-Mastermix in einem Reaktionsvolumen von 20 μL.
    3. Analysieren Sie die Daten quantitativ mit der 2-ΔΔCT-Methodeund drücken Sie sie als n-fache Differenz relativ zur Expression von β-Aktin aus. Die Grundierungen sind in Tabelle 2 dargestellt.

7. Western-Blotting (WB)

  1. Extrahieren Sie das gesamte Gewebeprotein.
    1. Geben Sie eine kleine Menge Gewebeblock in den kugelförmigen Teil des 1-2 mL Homogenisators und schneiden Sie den Gewebeblock mit einer sauberen Schere so weit wie möglich ab.
    2. 400 μl (w:v=1:10) des RIPA-Lysepuffers zugeben und homogenisieren. Legen Sie es dann auf Eis. Nach einigen Minuten erneut mahlen und auf Eis legen. Wiederholen Sie den Mahlvorgang mehrmals.
    3. Nach 30 Minuten Lyse wird das Lysat mit einer Pipette in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und das Röhrchen in eine vorgekühlte 4 °C-Zentrifuge gelegt. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 2250 x g und überführen Sie den Überstand in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
  2. Quantifizieren Sie das Protein.
    1. Verdünnen Sie die Proteinstandards gemäß den Anweisungen des Kits. Ermitteln Sie die Gradienten der Standards wie folgt: 0, 25, 125, 250, 500, 1000, 1500 und 2000 ng/μL.
    2. Entnehmen Sie 2,5 μl der Proteinprobe und verdünnen Sie sie mit dem Probenverdünnungsmittel auf 25 μl (10-fach).
    3. Nehmen Sie eine 96-Well-Platte und geben Sie 20 μl der Standardproteinprobe (entsprechend dem Konzentrationsgradienten) und des Zielproteins in die Wells bzw. zwei Wells für jede Zielproteinprobe.
    4. Bereiten Sie die Entwicklungslösung (gebrauchsfertig) vor, indem Sie Flüssigkeit A und Flüssigkeit B im Verhältnis 50:1 mischen und 200 μl Entwicklungslösung in jede Vertiefung geben.
    5. Stellen Sie die 96-Well-Platte mit den hinzugefügten Proben für 30 Minuten in einen Inkubator bei 37 °C.
    6. Detektieren Sie die Extinktion bei 562 nm.
    7. Berechnen Sie die Konzentration des zu messenden Proteins.
      1. Nehmen Sie die Standardproteinkonzentration als vertikale Koordinate und die Absorption bei 562 nm als horizontale Koordinate, um die Standardkurve zu zeichnen.
      2. Berechnen Sie die Konzentration des Zielproteins auf der Grundlage der Formel aus der Standardkurve und der gemessenen Absorption des Zielproteins.
    8. Geben Sie 180 μl Ladepuffer zu 20 μl Proteinprobe in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen in ein Metallbad und denaturieren Sie es 10 Minuten lang bei 100 °C. Verwenden Sie das denaturierte Protein WB oder lagern Sie es bei -20 °C.
  3. Führen Sie Immunblotting durch.
    1. Konfigurieren Sie das Proteinelektrophorese-Gel.
      1. Reinigen und föhnen Sie die Gelgussglasplatte (1 mm oder 1,5 mm) und befestigen Sie sie auf dem Gelgießgerät.
      2. Bereiten Sie 10% Trenngel gemäß Tabelle 3 vor. Geben Sie das konfigurierte Trenngel zwischen die Glasplatten. Geben Sie die Gellösung langsam hinzu, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Fügen Sie dann eine angemessene Menge wasserfreies Ethanol hinzu, um die flüssige Oberfläche des Separators abzuflachen. Lassen Sie es 20-30 Minuten bei RT, bis das Gel fest geworden ist.
        HINWEIS: Je höher das Molekulargewicht, desto niedriger die Leimkonzentration, je nachdem, wie wichtig es ist, andere Konzentrationen des Trennklebers zu formulieren.
      3. Bereiten Sie 5% konzentriertes Gel gemäß Tabelle 3 vor. Gießen Sie nach dem Erstarren des Trenngels die obere Schicht aus wasserfreiem Ethanol ab, füllen Sie das konzentrierte Gel auf und führen Sie langsam den Gelkamm ein, der zur Glasplatte passt (achten Sie darauf, dass keine Luftblasen entstehen). Lassen Sie es 20-30 Minuten bei RT, damit sich das konzentrierte Gel verfestigt.
    2. Führen Sie eine Elektrophorese durch.
      1. Wiegen Sie 60,5 g Tris, 375 g Glycin und 20 g Natriumdodecylsulfat (SDS). 2 l mit Wasser auffüllen, auf 60 °C erhitzen und umrühren, bis sich eine 10-fache Elektrophoreselösung bildet. Lassen Sie die Lösung bei RT sein; Verdünnen Sie es bei Gebrauch auf 1x.
      2. Entfernen Sie die Glasplatte mit dem Klebstoff von der Gelgießvorrichtung, ziehen Sie den Leimkamm im Wasserstrom mit gleichmäßiger Geschwindigkeit nach unten und lassen Sie gleichzeitig die Luftblasen in der Probenahmeöffnung ab.
      3. Befestigen Sie die Glasplatte im Elektrophoresebehälter und fügen Sie die konfigurierte 1x Elektrophoreselösung hinzu. Stellen Sie sicher, dass der Innentank voll ist und dass der Außentank die Hälfte des Innentanks beträgt.
      4. Geben Sie die gleiche Masse der Proteinprobe und 5 μl Marker (zur Angabe der Proteingröße) in die Probenzugabevertiefung.
      5. Lassen Sie das Gel 20 min lang bei 60 V laufen, dann 90 min lang bei 100 V, bis der Ladepuffer nach unten läuft.
    3. Führen Sie den Membrantransfer durch.
      1. Wiegen Sie 60 g Tris und 288 g Glycin und fügen Sie Wasser zu 2 l hinzu. Rühren Sie die Lösung gut um und lösen Sie sie gut auf, um eine 10-fache Membrantransferlösung herzustellen, und bewahren Sie sie bei RT auf. Verdünnen Sie sie im Verhältnis 1:2:7 (10x Transmembranlösung: Methanol: Wasser), um eine 1x Arbeitslösung herzustellen.
        HINWEIS: Die Transmembranlösung sollte im Voraus zubereitet und im Kühlschrank auf 4 °C abgekühlt werden.
      2. Weichen Sie das PVDF für einen angemessenen Zeitraum (0,5-1 min) in Methanol ein, um die positiv geladenen Gruppen auf der Membran zu aktivieren und die Bindung an negativ geladene Proteine zu erleichtern.
      3. Nehmen Sie den Membrantransferclip und befestigen Sie ihn, nachdem Sie die Komponenten in Ordnung gebracht haben (schwarze Oberfläche - Schwamm - Filter Papier - Elektrophorese Gel - PVDF Membran - Filter Papier - Schwamm - weiße Oberfläche in der Reihenfolge).
        HINWEIS: Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden. Wenn Luftblasen vorhanden sind, verwenden Sie die Walze, um die Luftblasen auszutreiben.
      4. Legen Sie die Schiene in den Membrantransfertank, achten Sie auf die korrekte Elektrodenplatzierung, legen Sie zwei Eisbeutel in den Tank und füllen Sie ihn mit 1x Membrantransferflüssigkeit auf. Zum Schluss legen Sie den gesamten Transmembrantank in Eis.
      5. Stellen Sie die Übertragungsbedingungen der Membran für 1 h auf 100 V ein.
        HINWEIS: Die Membrantransferzeit kann je nach Größe des Proteins angepasst werden. Je kleiner das Molekulargewicht des Proteins ist, desto kürzer ist die Übertragungszeit der Membran.
    4. Blockieren durchführen.
      1. Für phosphorylierte Proteine ist 5 % BSA (Lösungsmittel TBST) als Blockierungslösung zu verwenden. Für nicht phosphorylierte Proteine verwenden Sie 5%ige Magermilch (Lösungsmittel TBST) zum Blockieren.
      2. Gießen Sie die Blockierlösung in eine Schüssel geeigneter Größe. Legen Sie die PVDF-Membran in die Schale und stellen Sie sicher, dass die PVDF-Membran in die Blocklösung eingetaucht ist. Die Schale verschließen und 1 h bei RT inkubieren.
      3. Entfernen Sie die Membran. Entsprechend der Markeranzeige und der Größe jedes Zielproteins schneiden Sie die Membran in die entsprechende Größe und beschriften sie mit Seriennummern.
    5. Inkubieren des Antikörpers
      1. Entfernen Sie die Blockierlösung und saugen Sie die Restflüssigkeit mit Filterpapier auf. Geben Sie das entsprechende geschnittene PVDF in die entsprechenden Antikörperverdünnungen (einschließlich CPR78 [1:1000], TRAF2 [1:1000], p-JNK [1:1000], Caspase [1:1000] und GAPDH [1:1000]) und legen Sie es über Nacht bei 4 °C auf den Rotationsschüttler.
      2. 1x TBST zugeben und dreimal (je 10 min) bei RT spülen.
      3. Inkubieren Sie die PVDF-Membran in den Sekundärantikörperverdünnungen gemäß den Anweisungen des Herstellers und inkubieren Sie sie 1 h lang bei RT.
      4. Spülen Sie die Membran durch Zugabe von 1x TBST bei RT dreimal (je 10 min).
    6. Entwickeln Sie die PVDF-Membran.
      1. Mischen Sie gleiche Volumina von Flüssigkeit A und Flüssigkeit B im Lumineszenzlösungskit, schütteln Sie es gut und bereiten Sie die Verwendung vor.
      2. Legen Sie die PVDF-Membran zum Verteilen auf die Frischhaltefolie und geben Sie das vorbereitete Leuchtmittel schnell und gleichmäßig schnell und gleichmäßig auf die Membran. 3 Minuten bei RT inkubieren, dabei Licht vermeiden.
      3. Weisen Sie die Proteinbanden mit Western Blotting-Detektionsreagenzien (ECL) für die verstärkte Chemilumineszenz (ECL) nach.

8. Datenanalyse

  1. Geben Sie alle Daten als Mittelwert ± S.D. durch Führen Sie statistische Analysen mit einer einfachen ANOVA mit SPSS 20.0 durch. Betrachten Sie die Unterschiede als statistisch signifikant, wenn p 0,05 <.

Ergebnisse

Wie in Tabelle 4 und Tabelle 5 gezeigt, waren der systolische Blutdruck (SBP) und der diastolische Blutdruck (DBP) in der MET-Gruppe von 1 bis 4 Wochen signifikant höher als in der CON-Gruppe. Nach HTJDTLD-Behandlung waren die SBP und DBP der Ratten signifikant niedriger als die der MET-Gruppe. Bemerkenswert ist, dass die kombinierte Anwendung von HTJDTLD und EM eine stärkere blutdrucksenkende Wirkung hatte als die HTJDTLD-Behandlung allein.

Gemäß der HE-F...

Diskussion

Bluthochdruck ist eine der häufigsten Herz-Kreislauf-Erkrankungen, von der ein Drittel der erwachsenen Bevölkerung betroffen ist und die das Risiko für Schlaganfälle, koronare Herzkrankheiten sowie Herz- und Nierenversagen erhöht8. Die H-Typ-Hypertonie ist eine spezielle Form der Hypertonie, die sich auf das gleichzeitige Auftreten von primärer Hypertonie und erhöhtem Homocysteinspiegel bezieht und im Laufe der Jahre breite Aufmerksamkeit erregt hat9. In den letzten ...

Offenlegungen

Wir erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Jilin (Nr. YDZJ202301ZYTS189).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCRYeasen,China11149EScDNA synthesis kit 
Anti-beta-actin antibodyBioss, Chinabs-0061R
Anti-caspase-3 antibodyBioss, Chinabs-0081R
Anti-GPR78 antibodyAbcam, USAab108513
Anti-JNK antibodyAbcam, USAab76572
Anti-p-JNK antibodyBioss, Chinabsm-52462R
Anti-rabbit IgG antibodyBioss, Chinabs-0295G-HRP
Anti-TRAF2 antibodyBioss, Chinabs-22372R
Bio-Rad CFX96 Touch system Bio-RadCFX96real-time PCR detection system 
ECL Western Blot SubstratesMerck, MA, USAWBULP-10ML
Enalapril maleate folic acid tabletsYangzijiang Pharmaceutical Company, China20040991
FastStart SYBR Green MasterSigmaFSSGMMRO
Fructus TrichosanthisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
HirudoThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
intelligent noninvasive sphygmomanometer Beijing Softron Biotechnology companyBP-2010A
Lonicerae Japonicae FlosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
MethionineSigma, USAM9500
Radix Angelicae SinensisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma GlycyrrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma NardostachyosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Rhodiolae CrenulataeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Salviae MiltiorrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix ScrophulariaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Rat Hcy ELISA KitsShanghai Meimian Industrial Company, ChinaMM-0293R2
RIPA bufferShanghai Beyotime Biotechnology companyP0013B

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