Schnelle und effiziente Anreicherung von Mikroglia des Rückenmarks der Maus

Zusammenfassung

Mikroglia gelten als einige der vielseitigsten Zellen des Körpers, die zur morphologischen und funktionellen Anpassung fähig sind. Ihre Heterogenität und Multifunktionalität ermöglicht die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns und ist gleichzeitig mit verschiedenen neurologischen Pathologien verbunden. Hier wird eine Technik zur Reinigung von Rückenmarksmikroglia beschrieben.

Zusammenfassung

Die Wirbelsäule definiert ein Wirbeltier und formt den Wirbelkanal, einen Hohlraum, der das Rückenmark umschließt und schützt. Die richtige Entwicklung und Funktion des zentralen Nervensystems von Säugetieren hängt maßgeblich von der Aktivität der ansässigen Makrophagen ab, die als Mikroglia bekannt sind. Mikroglia weisen Heterogenität und Multifunktionalität auf, was eine unterschiedliche Genexpression und ein unterschiedliches Verhalten im Rückenmark und im Gehirn ermöglicht. Zahlreiche Studien haben die Funktion der zerebralen Mikroglia untersucht und die Reinigungsmethoden ausführlich beschrieben. Für die Reinigung von Mikroglia aus dem Rückenmark bei Mäusen fehlt jedoch eine umfassende Beschreibung. Im Gegensatz dazu fehlt der Verwendung einer hochgereinigten Kollagenase im Gegensatz zu einem unraffinierten Extrakt die Berichterstattung im Gewebe des zentralen Nervensystems. In dieser Studie wurden die Wirbelsäule und das Rückenmark von 8-10 Wochen alten C57BL/6-Mäusen herausgeschnitten. Bei der anschließenden Verdauung wurde eine hochgereinigte Kollagenase verwendet, und bei der Mikrogliareinigung wurde ein Dichtegradient verwendet. Die Zellen wurden für die Durchflusszytometrie gefärbt, wobei die Lebensfähigkeit und Reinheit durch CD11b- und CD45-Färbung beurteilt wurde. Die Ergebnisse ergaben eine durchschnittliche Viabilität von 80 % und eine mittlere Reinheit von 95 %. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Manipulation der Mikroglia der Maus eine Verdauung mit einer hochgereinigten Kollagenase beinhaltete, gefolgt von einem Dichtegradienten. Dieser Ansatz erzeugte effektiv beträchtliche Populationen von Rückenmark-Mikroglia.

Einleitung

Das bestimmende Merkmal von Wirbeltieren ist die Wirbelsäule oder Wirbelsäule, in der der Notochord durch eine Abfolge segmentierter Knochen ersetzt wurde, die als Wirbel bezeichnet werden und durch Bandscheiben getrennt sind. Diese Abfolge von knöchernem Material formt den Spinalkanal, einen Hohlraum, der das Rückenmark umschließt und schützt¹. Bei der Gattung Rodentia besteht die Wirbelsäule in der Regel aus sieben Halswirbeln, dreizehn Brustwirbeln, sechs Lendenwirbeln und einer variablen Anzahl von Schwanzwirbeln ^2,3. Die Länge des Rückenmarks ähnelt der der Wirbelsäule, un....

Protokoll

Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der offiziellen mexikanischen Norm NOM-062-ZOO-1999 und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Die Genehmigung für die Studie wurde von den Ausschüssen für Forschung, Ethik und Biosicherheit des mexikanischen Kinderkrankenhauses (HIM/2023/006) und der Kommission für Forschung und Bioethik des Allgemeinen Krankenhauses von Mexiko Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62) erteilt. Drei C57BL/6-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden aus dem Mexico Children's Hospital bezogen, wo sie unter isolierten Bedingungen in belüfteten Racks in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für die Pflege....

Diskussion

Für die Untersuchung von Mikroglia wurden aufgrund ihrer Bedeutung für die Homöostase des Gehirns zahlreiche Protokolle entwickelt. Bei diesen Methoden werden Mikroglia typischerweise aus den Großhirnhemisphären von embryonalen oder neonatalen Ratten und Mäusen gewonnen¹⁷. Eine begrenzte Anzahl von Studien befasste sich mit der Reinigung von Mikroglia aus dem Rückenmark erwachsener Mäuse^13,14. Diese Techniken beinhalten eine enzyma.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining