Entwicklung von Sehnen-Assembloiden zur Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen bei Krankheit und Reparatur

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein assembloides Modellsystem vor, um die zelluläre Wechselwirkung zwischen dem tragenden Sehnenkerngewebe und einem extrinsischen Kompartiment mit Zellpopulationen nachzuahmen, die durch Krankheit und Verletzung aktiviert werden. Als wichtigen Anwendungsfall demonstrieren wir, wie das System eingesetzt werden kann, um die krankheitsrelevante Aktivierung von extrinsischen Endothelzellen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Sehnen ermöglichen die Fortbewegung, indem sie Muskelkräfte auf die Knochen übertragen. Sie stützen sich auf einen zähen Sehnenkern aus Kollagenfasern und Stromazellpopulationen. Dieser tragende Kern wird von einer synovialartigen Gewebeschicht, die das extrinsische Sehnenkompartiment umfasst, umschlossen, genährt und repariert. Trotz dieses ausgeklügelten Designs sind Sehnenverletzungen häufig, und die klinische Behandlung stützt sich immer noch auf Physiotherapie und Operationen. Die Einschränkungen der verfügbaren experimentellen Modellsysteme haben die Entwicklung neuartiger krankheitsmodifizierender Behandlungen und rückfallverhindernder klinischer Regime verlangsamt.

In-vivo-Studien am Menschen beschränken sich auf den Vergleich gesunder Sehnen mit erkranktem oder gerissenem Gewebe im Endstadium, das während einer Reparaturoperation entnommen wurde, und erlauben keine Längsschnittuntersuchung der zugrunde liegenden Sehnenerkrankung. In-vivo-Tiermodelle weisen auch wichtige Grenzen in Bezug auf die undurchsichtige physiologische Komplexität, die ethische Belastung der Tiere und die mit ihrer Verwendung verbundenen hohen wirtschaftlichen Kosten auf. Darüber hinaus eignen sich In-vivo-Tiermodelle schlecht für die systematische Untersuchung von Medikamenten und mehrzelligen, multigewebeübergreifenden Interaktionswegen. Einfachere In-vitro-Modellsysteme sind ebenfalls unzureichend. Ein Hauptgrund ist das Versäumnis, die dreidimensionale mechanische Belastung angemessen zu replizieren, die für eine sinnvolle Untersuchung von Sehnenzellen und ihrer Funktion erforderlich ist.

Das hier vorgestellte neue 3D-Modellsystem entschärft einige dieser Probleme, indem es die Explantate des murinen Schwanzsehnenkerns nutzt. Wichtig ist, dass diese Explantate in großer Zahl von einer einzigen Maus aus leicht zugänglich sind, 3D-In-situ-Belastungsmuster auf zellulärer Ebene beibehalten und eine in vivo-ähnliche extrazelluläre Matrix aufweisen. In diesem Protokoll werden Schritt-für-Schritt-Anweisungen gegeben, wie Sehnenkernexplantate mit Kollagenhydrogelen angereichert werden können, die mit Muskel-Endothelzellen, Sehnen-Fibroblasten und aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen beladen sind, um krankheits- und verletzungsaktivierte Zellpopulationen innerhalb des extrinsischen Sehnenkompartiments zu ersetzen. Es wird gezeigt, wie die resultierenden Sehnenassembloide mechanisch oder durch definierte Mikroumgebungsreize herausgefordert werden können, um das entstehende multizelluläre Crosstalk während von Krankheiten und Verletzungen zu untersuchen.

Einleitung

In ihrer Funktion, Muskelkräfte auf die Knochen zu übertragen, um Bewegung zu ermöglichen, sind Sehnen einigen der extremsten mechanischen Belastungen ausgesetzt, die im menschlichen Körper auftreten ^1,2,3. Aufgrund alternder Gesellschaften, zunehmender Prävalenz von Fettleibigkeit und der wachsenden Beliebtheit mechanisch anspruchsvoller sportlicher Aktivitäten wird die Prävalenz von Sehnenerkrankungen und -verletzungen in den Industrieländern voraussichtlich steigen ^4,5,6. Die Entwicklung neuartiger evidenzbasierter und krankheitsmodifizierender Behandlungsschemata zur Bekämpfung dieses Anstiegs wurde durch Einschränkungen der derzeit verfügbaren Modellsysteme behindert ^1,7,8.

Im Idealfall würden Krankheits- und Verletzungsreparaturmodelle es ermöglichen, zu untersuchen, wie das Zielorgan einen definierten Satz von Eingangsparametern (imitieren Krankheitsauslöser, Tabelle 1) in messbare Ausgangsparameter (die Krankheitsmerkmale darstellen, Tabelle 2) verarbeitet und dabei Störfaktoren kontrolliert. Studien mit solchen Modellsystemen könnten dann die (patho-)physiologischen Prozesse identifizieren, die der Krankheits- und Verletzungsreparatur zugrunde liegen, und Erkenntnisse gewinnen, die genutzt werden könnten, um Krankheits- und Verletzungsmerkmale in den Kliniken zu verhindern oder zu reduzieren. Wendet man dieses Prinzip auf Sehnen an, sollte ein nützliches Modellsystem zentrale Teile der In-vivo-Sehnenreaktion auf Krankheiten und Verletzungen rekapitulieren, die die folgenden Merkmale umfassen: Mikroschäden, Entzündungen, Neovaskularisation, Hyperzellularität, beschleunigter Matrixumsatz und Dekompartimentierung 9,10,11,12,13,14,15 . Auf der Grundlage dieser Kennzeichen können die folgenden Anforderungen an ein erfolgreiches Modellsystem zur Reparatur von Sehnenerkrankungen und Verletzungen abgeleitet werden.

Es wird angenommen, dass mechanische Überlastung ein zentraler Faktor bei der Pathogenese von Sehnenverletzungen und Krankheiten ist und daher ein häufig verwendeter experimenteller Ansatz zur Erzeugung von Mikroschäden^{ist 16}. Eine kontrollierbare mechanische Belastung ist daher eine wesentliche Voraussetzung für Modelle zur Reparatur von Sehnenerkrankungen und Verletzungen. Im Idealfall ermöglicht das Modellsystem drei Hauptmodi: Einzeldehnungsbelastung, Ermüdungsbelastung und Entlastung ^8,17,18. Bei mechanischer Verformung erfahren geweberesidente Zellen eine komplexe Kombination aus Zugkräften, Scherkräften (aufgrund des Gleitens der Kollagenfasern, die die Zellen umgeben) und Druckkräften, die während der Entladung oder in der Nähe der Enthese auftreten^19,20. Modellsysteme sollten diese komplexen Belastungsmuster so genau wie möglich nachbilden.

Eine alternative Möglichkeit, Matrix-Mikroschäden einzuführen, besteht darin, biochemische Stressoren zu nutzen, die systemische Veranlagungen für Sehnenerkrankungen und -verletzungen nachahmen, wie z. B. (pro-)inflammatorische Zytokine, oxidativer Stress oder hohe Glukosekonzentrationen 21,22,23. Folglich ist eine kontrollierbare Nischenmikroumgebung für ein Modellsystem zur Reparatur von Sehnenerkrankungen und Verletzungen von Vorteil.

Eine häufige Voraussetzung dafür, dass Modellsysteme Entzündungen, Neovaskularisation und Hyperzellularität rekapitulieren können, ist das selektive Vorhandensein von Zellpopulationen, die diese Prozesse antreiben²⁴. Für entzündliche Prozesse umfassen diese Populationen Neutrophile, T-Zellen und Makrophagen, während Endothelzellen und Perizyten benötigt würden, um die Neovaskularisation zu untersuchen 25,26,27,28,29. Sehnenfibroblasten sind nicht nur für die Sehnenreparatur von entscheidender Bedeutung, sondern als proliferative und migrierende Zellen auch teilweise für die lokale Hyperzellularität verantwortlich, die bei Sehnenerkrankungen beobachtet wird 30,31,32,33,34,35,36.

Neben Veränderungen in den ansässigen Zellpopulationen ist die Zusammensetzung der Sehnenmatrix auch bei Sehnenerkrankungen und -verletzungen verändert 7,37,38,39,40. Um die richtigen krankheitsrelevanten Mikroumgebungshinweise zu präsentieren, sollten Modellsysteme in der Lage sein, eine extrazelluläre Matrixzusammensetzung zu integrieren, die auf das angestrebte Krankheits- oder Verletzungsstadium abgestimmt ist, indem sie beispielsweise relevante proportionale Kombinationen von Kollagen-1, Kollagen-3 und zellulärem Fibronektin^{ermöglichen 41}.

Die Kompartimentierung gesunder Sehnen in den Sehnenkern und die extrinsischen Kompartimente (d.h. Endotenon, Epitenon und Paratenon) ist für ihre Funktion von zentraler Bedeutung und bei erkrankten oder verletzten Sehnen häufig gestört 1,42,43,44,45,46,47 . Die Einbeziehung der 3D-Sehnenkompartimentierung in Sehnenmodellsysteme ist daher nicht nur erforderlich, um die Prozesse, die der De- und Rekompartimentierung zugrunde liegen, genauer zu simulieren, sondern hilft auch, die korrekten raumzeitlichen Gradienten von Zytokinen und Nährstoffen zu ermitteln^48,49.

Schließlich ist die Modularität ein weiterer zentraler Vorteil von Modellsystemen, die es den Forschern ermöglicht, den korrekten relativen Beitrag und das Zusammenspiel zwischen den zuvor beschriebenen Stressoren während der untersuchten Prozesse zu kombinieren ^8,17.

Neben der Auswahl der optimalen Eingabemodalitäten besteht ein wichtiger Schritt darin, Änderungen in der resultierenden Ausgabe messen, beobachten und verfolgen zu können. Die mechanischen Eigenschaften des Modellsystems (d. h. Länge des Zehenbereichs, linearer Elastizitätsmodul, maximale Zugdehnung, maximale Zugspannung, Dauerfestigkeit und Spannungsrelaxation) sind hier von zentraler Bedeutung, da sie die Hauptfunktion der Sehne^{charakterisieren} 50,51,52. Um diese funktionellen Veränderungen mit Veränderungen auf Gewebeebene zu verknüpfen, ist es wichtig, Methoden zum Nachweis von (Kollagen-)Strukturmatrixschäden und zur Verfolgung der Proliferation und Rekrutierung von krankheits- und reparaturrelevanten Zellpopulationen zu ermöglichen 30,53,54,55,56,57,58,59,60.

Um neu entstehende Zell-Zell- und Zell-Matrix-Crosstalk zu untersuchen, sollte man in der Lage sein, Proteine in ausreichenden Mengen für die Quantifizierung zu isolieren oder zu markieren (d. h. ELISA, Proteomik, Immunhistochemie, Durchflusszytometrie)14,21,61,62. Populations- oder zumindest kompartimentspezifische Genexpressionsanalysen sollten ebenfalls möglich sein (d.h. fluoreszenzaktivierte Zellsortierung [FACS], Einzelzell-/Bulk-RNA-Sequenzierung und quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)⁾21,24,27,63. Das Modellsystem sollte es ermöglichen, so viele der oben genannten Ausgabeparameter an derselben Probe und an mehreren Proben so schnell zu messen, dass Hochdurchsatzstudien möglich sind.

Unter den Modellsystemen, die derzeit zur Untersuchung menschlicher Sehnenerkrankungen und der Reparatur von Verletzungen zur Verfügung stehen, ist der menschliche Körper selbst natürlich das repräsentativste. Es ist auch am wenigsten kompatibel mit experimentellen Eingriffen. Während Patienten mit akuten Sehnenverletzungen für klinische Studien reichlich zur Verfügung stehen, sind Patienten mit früher Tendinopathie (der häufigsten Sehnenerkrankung) weitgehend symptomfrei und bleiben klinisch oft unentdeckt, bis sich schwerere Veränderungen manifestieren 14,64,65. Dies macht es schwierig, den kritischen Moment zu bestimmen, in dem die Sehnenhomöostase entgleist, und die Mechanismen hinter dieser Entgleisung 16,66,67,68,69. Darüber hinaus ist die Entnahme von Biopsien aus gesunden Sehnen ethisch anspruchsvoll, da sie zu anhaltenden Schäden führen kann. Überreste der vorderen Kreuzbandrekonstruktion werden häufig als gesunde Kontrollen verwendet, unterscheiden sich jedoch wohl in Funktion, mechanischen Eigenschaften, Zellpopulationen und Matrixzusammensetzung im Vergleich zu Rotatorenmanschette, Achillessehne und Patellasehnen, die häufig von Sehnenerkrankungen und -verletzungen betroffen sind 70,71,72,73.

In-vivo-Tiermodelle sind leichter zugänglich und handhabbar, aber ihre Verwendung stellt eine erhebliche ethische Belastung für die Tiere und wirtschaftliche Kosten für die Forscher dar. Darüber hinaus entwickeln die meisten der beliebten Modelltiere entweder keine tendinopathischen Läsionen spontan (z. B. Ratten, Mäuse, Kaninchen) oder es fehlen die Primer und genetisch veränderten Stämme, die erforderlich sind, um die daran beteiligten multizellulären Kommunikationswege zu verfolgen (z. B. Pferde, Kaninchen).

Einfache 2D-In-vitro-Modellsysteme befinden sich auf der anderen Seite des Komplexitäts-/Lenkbarkeitsspektrums und ermöglichen eine kontrollierte, zeiteffiziente Untersuchung spezifischer interzellulärer Kommunikationswege als Reaktion auf einen besser kontrollierbaren Satz von Auslösern ^8,74. Diese vereinfachten Systeme können jedoch häufig nicht die mehrdimensionale mechanische Belastung (d. h. Zug, Druck und Scherung) rekapitulieren, die für die Sehnenfunktionalität von zentraler Bedeutung ist. Darüber hinaus neigen die (zu) hohen Steifigkeiten von Gewebekulturkunststoffen dazu, alle Matrixhinweise zu überschreiben, die von Beschichtungen bereitgestellt werden, die den interessierenden Krankheitszustand nachahmen sollen^75,76.

Um diesen Nachteil zu überwinden, wurden immer ausgefeiltere Tissue-Engineering-3D-Modellsysteme entwickelt, um eine belastbare Matrix bereitzustellen, deren Zusammensetzung zumindest teilweise auf den gewünschten Krankheitszustand abgestimmt werden kann 77,78,79. Dennoch haben diese Systeme nicht nur Schwierigkeiten, die komplexen extrazellulären In-vivo-Matrixzusammensetzungen und zellulären Belastungsmuster genau zu replizieren, sondern es fehlt ihnen im Allgemeinen an langfristiger Belastbarkeit und den kompartimentellen Schnittstellen, die erforderlich sind, um die kompartimentübergreifenden Kommunikationswege zu untersuchen, die Sehnenerkrankungen und die Reparatur von Verletzungen koordinieren 48,49,80.

Ex-vivo-Sehnenexplantat-Modellsysteme haben den entscheidenden Vorteil einer eingebauten in vivo-ähnlichen Matrixzusammensetzung, die perizelluläre Nischen, kompartimentübergreifende Barrieren sowie raumzeitliche Zytokin-/Nährstoffgradienten umfasst und komplexe Belastungsmuster rekapituliert, wenn sie gedehnt werden ⁸. Aufgrund der größenabhängigen Nährstoffdiffusionsgrenzen sind Explantate aus größeren Tiermodellen (z. B. Pferden) für die Langzeitstudie von Sehnenerkrankungen und Verletzungsreparaturen schwer am Leben zu erhalten 81,82,83. Kleinere Explantate von Mausarten (z. B. Achillessehne, Patellasehne) sind jedoch nur schwer reproduzierbar zu klemmen und mechanisch zu belasten. Ihre Größe schränkt auch die Menge an Material ein, die für Auslesungen auf Zell-, Protein- und Genebene gesammelt werden kann, ohne Proben zu bündeln und den Durchsatz zu verringern. In diesem Sinne bieten murine Schwanzsehnenfaszikel das Potenzial, Hochdurchsatzstudien zur Reparatur von Sehnenerkrankungen und Verletzungen zu ermöglichen, da sie in großen Mengen von einer einzigen Maus zur Verfügung stehen, die komplexe perizelluläre Matrixzusammensetzung in vivo erhalten und zelluläre Belastungsmuster rekapitulieren. Während des Extraktionsprozesses verlieren sie jedoch den größten Teil ihres extrinsischen Kompartiments und die darin enthaltenen vaskulären, Immun- und Fibroblastenpopulationen, von denen heute angenommen wird, dass sie Sehnenerkrankungen vorantreiben und reparieren ^8,18.

Um diese Lücke zu schließen, wurde ein Modellsystem entwickelt, das die Vorteile von murinen Schwanzsehnen-abgeleiteten Kernexplantaten mit den Vorteilen von 3D-Hydrogel-basierten Modellsystemen kombiniert. Dieses Modellsystem besteht aus einem zellbeladenen (Kollagen-1) Hydrogel, das um Schwanzsehnenexplantate^{gegossen wurde 84,85}. In dieser Arbeit werden die notwendigen Herstellungsschritte detailliert beschrieben, zusammen mit nützlichen Messwerten, die durch Co-Kultivierung von Kernexplantaten (intrinsisches Kompartiment) innerhalb eines endothelzellbeladenen Typ-1-Kollagenhydrogels (extrinsisches Kompartiment) erhalten werden können.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden von den zuständigen Behörden zugelassen (Kanton Zürich Bewilligungsnummern ZH104-18 und ZH058-21). Eine Übersicht ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Isolierung von Sehnenassembloidkomponenten von 12-15 Wochen alten Mäusen (d.h. B6/J-Rj)

1. Euthanasieren Sie die Mäuse durch CO₂ -Gas-induzierte Erstickung. Um die Ausbeute zu maximieren, verarbeiten Sie nicht mehr als 3 Mäuse gleichzeitig und fahren Sie unmittelbar nach der Euthanasie mit der Zellisolierung fort.
2. Stellen Sie den Tod durch bilaterale Induktion eines Pneumothorax sicher.
3. Sterilisieren Sie die Maushaut mit 80% Ethanol und bringen Sie die Maus in eine sterile Biosicherheitshaube.
4. Explantate aus dem Schwanzsehnenkern isolieren.
   1. Trennen Sie den Schwanz mit einem Skalpell (Nr. 21) von der Maus, indem Sie ihn an der Basis abschneiden.
   2. Beginnen Sie an der Spitze des Schwanzes, greifen Sie ihn mit der Pinzette und wackeln Sie damit, um die Haut zu brechen. Ziehen Sie dann die Pinzette vorsichtig vom Schwanz weg, um die Explantate des Sehnenkerns freizulegen.
   3. Legen Sie die Sehnenkernexplantate in das Standard-Nährmedium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 1% Amphotericin + 1% nicht-essentielle Aminosäuren) und trennen Sie sie mit einer frischen Skalpellklinge (Nr. 21) vom weggezogenen Schwanzteil.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.2. und 1.4.3. bis der ganze Schwanz verarbeitet ist und die Sehnenexplantate kürzer als 25 mm werden.
   5. Schneiden Sie die isolierten Kernexplantate mit einer frischen Skalpellklinge (Nr. 21) in 25 mm lange Stücke.
   6. Messen Sie den mittleren Durchmesser der Kernexplantate mit einem Lichtmikroskop, das über eine aufsteckbare digitale C-Mount-Kamera mit einer Bildanalysesoftware verbunden ist.
      1. Verwenden Sie Point and Click, um das Linienmesswerkzeug auf der rechten Seite auszuwählen.
      2. Messen Sie den Explantatdurchmesser an drei verschiedenen Stellen und berechnen Sie ihren mittleren Durchmesser.
      3. Um die spätere Klemmung und mechanische Prüfung zu erleichtern, wird nur mit Kernexplantaten mit einem mittleren Durchmesser von mehr als 100 μm verfahren.
   7. Die Entladung in Kombination mit der Exposition unter Standardkulturbedingungen (37 °C, 20% O₂, Serumsupplementierung) verändert die Genexpression innerhalb von 6 h nach der Isolierung und führt zu einem Abbau innerhalb von 7 Tagen²¹. Um mit einem quasi-homöostatischen Zustand zu beginnen, stellen Sie die Sehnenassembloide her und beginnen Sie die Experimente unmittelbar nach der Isolierung des Sehnenkerns.
   8. Je nach Versuchsaufbau werden devitalisierte Sehnenkernexplantate als Kontrollgruppe benötigt. Um Sehnenkern-Explantate zu devitalisieren, frieren Sie sie in einem kleinen Behälter mit flüssigem Stickstoff für 5 s mit einer Pinzette ein und tauen Sie sie dann 5 s lang bei Raumtemperatur (RT) auf. Wiederholen Sie diesen Gefrier-Tau-Zyklus 3 Mal und fahren Sie mit Schritt 4 fort ("Einspannen der Kernexplantate).
      VORSICHT: Flüssiger Stickstoff kann Kälteverbrennungen, Erstickung und Versprödung vieler gewöhnlicher Materialien verursachen. Verwenden Sie nur Behälter, die für Flüssigkeiten mit niedriger Temperatur ausgelegt sind, und tragen Sie Schutzkleidung (z. B. Gesichtsschutz, geeignete Handschuhe, geschlossene Schuhe).
5. Isolieren Sie Sehnenfibroblasten.
   1. Verwenden Sie ein Skalpell (Nr. 21), um einen Querschnitt in der Mitte des Mausfußes zu machen. Machen Sie von jedem Ende dieses Schnitts zwei Schnitte senkrecht zum Fuß entlang der Seiten der Hinterbeine und bis zu den Hüften.
   2. Fixieren Sie mit der Pinzette den ausgeschnittenen Hautlappen am Fuß und ziehen Sie die Haut ab, die die Wadenmuskulatur bedeckt. Wenn Sie Endothelzellen von derselben Maus isolieren, entfernen Sie stattdessen die gesamte Haut.
   3. Trennen Sie die Achillessehne mit einer frischen Skalpellklinge (Nr. 21) vom Fersenbein. Fixieren Sie das lose Ende der Achillessehne mit der Pinzette und trennen Sie das andere Ende vom Gastrocnemius-Muskel.
   4. Waschen Sie die Achillessehne einmal in PBS und entfernen Sie mit dem Skalpell (Nr. 21) das gesamte verbleibende Muskelgewebe, bis nur noch das weiße Sehnengewebe übrig bleibt. Wenn Endothelzellen aus derselben Maus isoliert werden, belassen Sie die Achillessehne in PBS und fahren Sie mit Schritt 1.6 fort. erste.
   5. Die Achillessehnen eines Tieres in ein 15-ml-Kunststoffröhrchen mit 10 ml Sehnenverdauungsmedium (DMEM/F12 + 1 % Penicillin/Streptomycin + 1 % Amphotericin + 2 mg/ml Kollagenase 1) geben und 6-8 Stunden bei 37 °C unter langsamem, konstantem Rühren mit einem Orbitalschüttler mit niedriger Drehzahl bei 15 U/min verdauen.
   6. Die verdaute Sehnenlösung bei 500 x g für 5 min bei RT zentrifugieren, den Überstand aspirieren und in 8 ml Standardkulturmedium (DMEM/F12 + 10 % FBS + 1 % Penicillin/Streptomycin + 1 % Amphotericin + 1 % nicht-essentielle Aminosäuren) resuspendieren und in einem T25-Kulturkolben unter Standardkulturbedingungen (37 °C, 20 % O₂) 7 Tage lang ohne Medienwechsel kultivieren. Wechseln Sie danach einmal pro Woche das Medium.
   7. Die Zellen werden bei 80 % Konfluenz in einen T150-Kulturkolben (1:6) aufgeteilt. Frieren Sie die Zellen an der Passage 2 in 2 ml steril gefiltertem Gefriermedium (70 % DMEM/F12 + 20 % FBS + 10 % DMSO) ein, verteilt auf zwei 1,5-ml-Kryoröhrchen, und halten Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C. Verwenden Sie Trypsin, um die Zellen aus dem Gewebekulturkunststoff zu entfernen.
6. Isolieren Sie aus Muskeln gewonnene Endothelzellen.
   1. Wenn Sehnenfibroblasten nicht aus derselben Maus isoliert werden, beginnen Sie mit den Schritten 1.5.1 und 1.5.2.
   2. Trennen Sie die Hinterbeine mit einer Schere vom Körper, indem Sie am Hüftgelenk schneiden.
   3. Die Hinterbeine einmal in kaltem PBS (~ 4 °C) waschen, die Muskeln (Quadrizeps femoris, Extensor digitorum longus, Soleus und Gastrocnemius) mit einem Skalpell (Nr. 21) entfernen und die Muskeln in eine Petrischale auf Eis legen.
   4. Verwenden Sie eine frische Skalpellklinge (Nr. 21), um das Muskelgewebe in Stücke zu zerkleinern, die kleiner als 1 mm³ sind, während Sie die Petrischale auf Eis halten.
   5. Das zerkleinerte Muskelgewebe beider Hinterbeine wird in ein 50-ml-Kunststoffröhrchen mit 12,5 ml Muskelverdauungsmedium (PBS + 2 mg/ml Kollagenase IV + 2 mg/ml Dispase II + 2 mM CaCl₂) gegeben.
   6. Legen Sie den Kunststoffschlauch für 10 min in ein 37 °C warmes Wasserbad. Schütteln Sie die Lösung kräftig und stellen Sie sie für weitere 10 Minuten zurück. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Lösung homogen erscheint und nur noch (weiße) Sehnen- und Faszienstücke übrig bleiben (ca. 4 x 10 min). Fahren Sie in der Zwischenzeit mit der Sehnenfibroblastenisolierung oder der Makrophagenisolierung fort.
   7. Geben Sie 12,5 ml kaltes PBS + 10% FBS in das Kunststoffröhrchen, um den Aufschluss zu stoppen.
   8. Verwenden Sie einen batteriebetriebenen Pipettenhalter, der mit einer 50-ml-Pipette ausgestattet ist, um die Suspension aus dem Kunststoffröhrchen anzusaugen. Statten Sie das Kunststoffrohr mit einem 400-μm-Zellsieb aus und filtern Sie die Suspension, um Schmutz zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem 100 μm Zellsieb.
   9. Die gefilterte Suspension bei 400 x g 5 min bei RT zentrifugieren. In 10 ml kaltem PBS + 10% FBS resuspendieren und erneut zentrifugieren.
   10. Resuspendieren Sie in 8 ml Endothelkulturmedium (1:1-Mischung aus DMEM/F12 und dem Endopan 3-Kit + 10 U/ml Heparin + 20 % FBS + 1 % Penicillin/Streptomycin + 1 % Amphotericin + 30 mg/ml Endothelwachstumsergänzung), ergänzt mit Puromycin (4 mg/ml) zur Populationsauswahl.
   11. Die Zellen einer Maus werden in einen T25-Kulturkolben ausgesät, der zuvor 2 h lang bei 37 °C mit 2 ml einer sterilen 0,2%igen Gelatinelösung beschichtet und dann nach Entfernen der überschüssigen Lösung über Nacht bei RT getrocknet wurde. Bereiten Sie die Kolben am Tag vor der Isolierung vor.
   12. Entfernen Sie nach 24 Stunden unter Standardkulturbedingungen (37 °C, 20 % O₂) das Puromycin-Ergänzungsmedium, waschen Sie die anhaftenden Zellen einmal mit PBS und kultivieren Sie sie in 8 ml endothelialem Kulturmedium.
   13. Die Zellen werden 1:5 bei 80% Konfluenz in gelatinebeschichtete Kolben geleitet und in Experimenten bis P2 verwendet. Verwenden Sie eine andere Zellablösungslösung als Trypsin (Materialtabelle), um die Zellen aus dem Gewebekulturkunststoff zu entfernen und nicht einzufrieren.
7. Isolieren Sie aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen.
   1. Wenn Sehnenfibroblasten oder Endothelzellen nicht aus derselben Maus isoliert werden, führen Sie zuerst die Schritte 1.5.1, 1.5.2, 1.6.2 und 1.6.3 aus.
   2. Nach dem Entfernen der Haut, der Sehne und des Muskelgewebes werden die übrig gebliebenen Knochen (Femur und Tibia) einmal in kaltem PBS (~4 °C) gewaschen.
   3. Legen Sie die Knochen in frisches, kaltes PBS (~4 °C) und schneiden Sie die Epiphysen mit einem Skalpell (Nr. 21) schrittweise ab, bis das Knochenmark freigelegt ist. Es erscheint als roter Punkt auf beiden Seiten des Knochens.
   4. Statten Sie eine Spritze mit einer 0,4 mm x 25 mm (G27) Injektionsnadel aus und füllen Sie sie mit 10 ml Makrophagen-Kulturmedium (DMEM/F12 + 10 % FBS + 1 % Penicillin/Streptomycin + 1 % Amphotericin + 1 % nicht-essentielle Aminosäuren).
   5. Halten Sie einen Knochen nach dem anderen über ein 50-ml-Kunststoffröhrchen, führen Sie die Injektionsnadel etwa 1 mm tief in das freiliegende Knochenmark oben ein und spülen Sie das Knochenmark durch Entleeren der Spritze aus. Das ausgeschwemmte Knochenmark erscheint als rötliche röhrenartige Struktur, wenn es im Medium suspendiert ist.
   6. Lösen Sie das Knochenmark auf, indem Sie es mit einer 1-ml-Pipettenspitze wiederholt vorsichtig auf und ab pipettieren. Verwenden Sie einen batteriebetriebenen Pipettenhalter, der mit einer 50-ml-Pipette ausgestattet ist, um die Zellsuspension durch ein 100-μm-Zellsieb zurück in das 50-ml-Kunststoffröhrchen zu filtern, und zentrifugieren Sie es bei 350 x g für 5 Minuten bei RT.
   7. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC) und zentrifugieren Sie erneut bei 350 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
   8. Resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml Makrophagen-Kulturmedium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 1% Amphotericin + 1% nicht-essentielle Aminosäuren) und säen Sie es in unbehandelte Petrischalen mit einem Durchmesser von 100 mm (5-8 x 10⁶ Zellen pro Schale).
   9. Nach 4 Stunden geben Sie 5 ml Makrophagen-Kulturmedium, ergänzt mit 40 ng/ml Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (m-CSF), in das Zellkulturmedium ohne m-CSF (1:1-Mischung), um eine Endkonzentration von 20 ng/ml m-CSF zu erreichen.
   10. Verwenden Sie die Zellen nach 6 Tagen in Experimenten oder frieren Sie sie bis zur weiteren Verwendung ein. Verwenden Sie eine andere Zellablösungslösung als Trypsin (Materialtabelle), um die Zellen aus dem Gewebekulturkunststoff zu entfernen.
       HINWEIS: Nach der Isolierung dehnen sich die Zellen nicht mehr aus. Die hier beschriebenen Zellisolationsmethoden funktionieren auch bei Mäusen und Ratten außerhalb der angegebenen Altersgruppe.
8. Um den Phänotyp der isolierten Zellpopulationen mit der Durchflusszytometrie zu überprüfen, fahren Sie mit Schritt 6.3.4 fort.

2. Kollagenisolierung von Wistar- oder Sprague-Dawley-Ratten

1. Befolgen Sie das an anderer Stelle ausführlich beschriebene Isolationsprotokoll⁸⁶. Es funktioniert auch mit Mäusen, wenn auch mit einem viel geringeren Ertrag.
2. Bestimmen Sie die Konzentration der resultierenden Lösung mit einem Hydroxyprolin-Assay, beurteilen Sie die Reinheit mit SDS-page und lagern Sie die Lösung bei 4 °C bis zur Verwendung in den Experimenten.

3. Herstellung der Komponenten des Kultursystems

1. Drucken Sie die Klemmhalter, die Montagestation und die Kammerformen in 3D.
   1. Laden Sie die angehängte .stl-Datei (Ergänzungsdatei 1) für die Klemmhalter, die Montagestation und die Kammerformen in die Slicing-Software. Um die Objektnummern nach Bedarf anzupassen, wählen Sie Objekte durch Zeigen und Klicken aus und kopieren Sie sie, um sie zu multiplizieren.
   2. Drücken Sie G-Code exportieren (Strg-R), um den G-Code zu generieren und dann zu exportieren (Strg-G).
   3. Laden Sie den G-Code in einen 3D-Drucker.
   4. Verwenden Sie für den Druckprozess ungefärbte, biokompatible Filamente (z. B. Polymilchsäure).
   5. Schneiden Sie mit einem Gewindeschneider 3 mm Gewinde in die Löcher des Klemmhalters, der die Schrauben trägt (Ergänzungsdatei 2 und Ergänzungsdatei 3, Löcher 1 und 3).
   6. Stecken Sie Edelstahl-Passstifte in das Loch auf der Rückseite des Klemmhalters (Ergänzungsdatei 2 und Ergänzungsdatei 3, Loch 4).
   7. Sterilisieren Sie die Klemmhalter und die Montagestation vor Gebrauch mindestens 1 h mit UV-Licht. Verwenden Sie 3D-gedruckte Klemmhalter nicht wieder.
   8. Alternativ können die Klemmenhalter und die Montagestation mit Polyetherimid unter Verwendung der beigefügten Pläne (Zusatzdatei 2, Zusatzdatei 3 und Zusatzdatei 4) hergestellt werden, was teurer ist, aber bessere Sterilisationsmethoden (d. h. Autoklavieren) und wiederholte Verwendung ermöglicht.
2. Gießen Sie die Kammern mit den 3D-gedruckten Formen.
   1. Füllen Sie die Kammerformen mit Silikon.
   2. Entgasen Sie das Silikon in einer Vakuumkammer (90 mbar) für 30 min.
   3. Lassen Sie die Lösung über Nacht bei RT oder auf einer Heizplatte bei 70 °C für 1 h polymerisieren, abhängig von der Hitzebeständigkeit der für die Formen verwendeten Filamente.
   4. Entfernen Sie vorsichtig die polymerisierten Kammern aus den Formen und schneiden Sie überflüssiges Silikon mit einem Skalpell (Nr. 21) ab.
   5. OPTIONAL: Sollen die Assembloide und damit die umgebenden Kammern mechanisch belastet werden, verstärken Sie die Löcher in den Silikonkammern mit Hohlrohren aus Edelstahl.
3. Bearbeiten Sie die Metallklammern aus Edelstahl anhand des beigefügten Plans (Ergänzungsdatei 5).
4. Waschen Sie vor jedem Gebrauch die Edelstahlklemmen, die Polyetherimid-Klemmhalter, die Schrauben und die Silikonkammer.
   1. 10 min in 80 % Ethanol (EtOH) und 20 % Umkehrosmosewasser (ROW) beschallen.
   2. 10 min in 50 % EtOH und 50 % Isopropanol beschallen.
   3. 3x mit ROW spülen.
   4. 10 min in 0,5 % alkalischem Reinigungskonzentrat beschallen (d. h. 3 ml in 600 ml ROW).
   5. 10 min in 0,5 % alkalischem Reinigungskonzentrat beschallen.
   6. 0,5% alkalisches Reinigungskonzentrat unter Schütteln 1 h 50 min einwirken lassen.
   7. 3x mit ROW spülen.
   8. 10 min hintereinander beschallen.
   9. Trocknen Sie die Komponenten an der Luft und autoklavieren Sie sie.

4. Einspannen der Kernexplantate

1. Setzen Sie passende Klemmhalter zusammen mit je einer Metallklemme in die Montagestation ein.
2. Legen Sie nasse autoklavierte Papierstücke (4 mm x 25 mm) auf die Metallklammern und schneiden Sie das Papier dann mit einem Skalpell (Nr. 21) entlang der Innenränder der Klammern ab. Schneiden Sie 2 zusätzliche, kleinere Papierstücke (4 mm x 1,5 mm) von einem anderen Papierstück ab und halten Sie sie feucht.
3. Legen Sie mit einer spitzen Pinzette 8 Kernexplantate auf das Papier zwischen den Metallklammern, wobei ihre Endpunkte auf den Metallklammern liegen.
4. Decken Sie die Endpunkte der Kernexplantate mit den vorbereiteten kleineren Papierstücken (4 mm x 1,5 mm) ab und legen Sie dann Metallklammern darauf. Verwenden Sie einen Schraubendreher und die kleinen Schrauben (M3 x 6 mm), um die Kernexplantate zwischen den Metallklemmen und dem Klemmhalter zu befestigen.
5. Übertragen Sie die eingespannten Kernexplantate vorsichtig in die Silikonkulturkammern und füllen Sie diese Kammern mit 2 ml Standard-Zellkulturmedium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 1% Amphotericin + 1% nicht-essentielle Aminosäuren).
6. OPTIONAL: Wenn die Assembloide/die umgebenden Kammern mechanisch belastet werden sollen, fixieren Sie diese mit zusätzlichen Schrauben (M3 x 16 mm) in Loch 3 (Ergänzungsdatei 2 und Ergänzungsdatei 3, Loch 3).

5. Kollagen-Hydrogel-Vorbereitung und -Guss

1. Entfernen Sie die Zielzellen mit einer Zellablösungslösung aus dem Gewebekulturkunststoff, zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei RT bei 400 x g und resuspendieren Sie sie in 1 ml Standardkulturmedium.
2. Für ein Assembloid sind 10 μl PBS (20x), 1,28 μl 1 M NaOH (125x), 8,72 μl doppelt destilliertes Wasser (ddH₂O, 23x), 80 μl Kollagen-1 (2,5x oder 1,6 mg/ml final) und 100 μl (2x) Standard-Nährmedien (für kern- und zellfreie Assembloide) oder Zellsuspension erforderlich. Bereiten Sie diese Komponenten in zwei separaten Lösungen vor und mischen Sie sie erst unmittelbar vor dem Gießen.
   1. Vernetzungslösung: Bündeln Sie das PBS, das NaOH, das ddH₂0 und die Zellsuspension von bis zu 12 Assembloiden (+10% Sicherheitsmarge) zu einer Vernetzungslösung und bewahren Sie sie in einem 15-ml-Kunststoffröhrchen auf Eis auf. Passen Sie die Konzentration der Zellsuspension an, um nach dem Mischen der beiden Lösungen die folgenden Endkonzentrationen zu erreichen: 250.000 Zellen/ml Sehnenfibroblasten, 500.000 Zellen/ml aus Muskeln gewonnene Endothelzellen oder 370.000 Zellen/ml aus Knochenmark gewonnene Makrophagen.
   2. Kollagen-1-Lösung: Die für bis zu 12 Assembloide benötigte Kollagen-1-Lösung (+10 % Sicherheitsmarge) in einem weiteren 15-ml-Kunststoffröhrchen zusammenfassen und auf Eis legen.
3. Sobald die Vernetzungslösung und die Kollagen-1-Lösung auf Eis fertig sind, saugen Sie das Zellkulturmedium aus den Kulturkammern mit den geklemmten Kernexplantaten an.
4. Geben Sie die Kollagen-1-Lösung mit einer 1000-μl-Pipette in die Vernetzungslösung und mischen Sie die beiden Lösungen, indem Sie schnell auf und ab pipettieren, ohne Blasen zu erzeugen. Bedecken Sie die einzelnen Sehnenkernexplantate mit 200 μl der gemischten Lösung, indem Sie sie in die von den Silikonkammern bereitgestellten Rillen pipettieren.
5. Lassen Sie die Hydrogele 50 min bei 37 °C polymerisieren.
6. Füllen Sie die Silikonkulturkammern vorsichtig mit 1,5 mL des jeweiligen Co-Kulturmediums, indem Sie es in die Ecken der Kammern pipettieren.
   1. Für die Kern-// Fibroblasten-Cokultur füllen Sie DMEM/F12, 10% FBS, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Amphotericin, 200 μM L-Ascorbinsäure, 20 ng/ml Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor.
   2. Für die Kern-/Makrophagen-Cokultur DMEM/F12, 10 % FBS, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % Amphotericin, 200 μM L-Ascorbinsäure, 20 ng/ml Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor einfüllen.
   3. Für die Kern-// Endothelzell-Cokultur füllen Sie eine 1:1-Mischung aus DMEM/F12 und dem Endopan 3-Kit + 10 U/ml Heparin + 20 % FBS + 1 % Penicillin/Streptomycin + 1 % Amphotericin + 30 mg/ml Endothelwachstumsergänzung.
7. Kultivieren Sie die Assembloide unter den für die Hypothese geeigneten Kulturbedingungen. Um beispielsweise eine läsionsähnliche Nischenumgebung nachzuahmen, kultivieren Sie sie bei 37 °C und 20 % O₂. Wechseln Sie das Nährmedium zweimal innerhalb von 1 Woche. Um Infektionen vorzubeugen, legen Sie die Kammern in eine große Petrischale oder eine sterile Box, bevor Sie sie in einen Inkubator geben.
   HINWEIS: Die Kulturzeit hängt von der Hypothese und dem Co-Kultur-Setup ab. Zum Beispiel werden Kern-// Fibroblasten-Assembloide in einer läsionsartigen Nischenumgebung nach etwa 3 Wochen mechanisch instabil.

6. Verfügbare Auslesemethoden

1. Führen Sie Fluoreszenzmikroskopie durch, einschließlich Viabilitäts- und Morphologie-Assays.
   1. Im Allgemeinen können die Assembloide als vollständige Halterungen abgebildet werden. Entfernen Sie dazu die Assembloide von den Klammern, indem Sie sie mit einer Schere in der Nähe der Klemmen schneiden und auf eine 12-Well-Platte übertragen.
   2. Waschen Sie die Assembloide einmal mit PBS.
   3. Wenn eine Viabilitätsanalyse durchgeführt wird, wird jedes Assembloid mit 100 μl 4 x 10⁻⁶ M Ethidium-Homodimer in PBS (EthD-1) für 20 min bei 37 °C im Dunkeln gefärbt.
   4. Waschen Sie die Assembloide 3x mit PBS und fixieren Sie sie dann mit 500 μl je 4% Formaldehyd für 20 min bei RT.
      VORSICHT: 4% Formaldehyd hat allergene, krebserregende und mutagene Wirkungen, ist fortpflanzungstoxisch und kann Entwicklungstoxizität (fortpflanzungsgefährdend) oder Organschäden verursachen. Tragen Sie Schutzkleidung und Handschuhe, Augenschutz und Maske oder anderen Atemschutz.
   5. Waschen Sie die Assembloide 3x mit PBS und fahren Sie mit dem Färbeprotokoll Ihrer Wahl fort. Eine Auswahl von Färbungen wurde bereits beschrieben^84,85.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Färbemittel, bei denen Fluorophore mit einer Emissionswellenlänge verwendet werden, die der der Kollagenautofluoreszenz (ca. 480 nm) nahe kommt.
2. Führen Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers eine kompartimentspezifische RNA-Isolierung für die RT-qPCR oder die genomweite RNA-Sequenzierung durch.
   1. Entfernen Sie die Assembloide mit einer Schere von den Klammern.
   2. OPTIONAL: Verwenden Sie eine Pinzette, um die Kernexplantate vom extrinsischen Hydrogelkompartiment zu trennen.
   3. Pool 20-24 20-mm-Kernexplantate oder 2 zellbeladene Kollagen-Hydrogele, um ausreichende Mengen an RNA zu isolieren.
   4. Verwenden Sie 1 ml kaltes Trizol und mechanische Unterbrechung (d. h. Metallkügelchen oder kryogenes Mahlen), um die extrazelluläre Matrix der gepoolten Kernexplantate oder der gepoolten Kollagenhydrogele zu zerstören.
      VORSICHT: Orale, dermale und inhalative Toxizität. Verursacht Haut- und Augenreizungen. Nur mit Handschuhen und in einer Chemikalienwerkbank anfassen.
   5. Fahren Sie mit der RNA-Isolierung aus dem Zelllysat unter Verwendung von Standard-RNA-Extraktionskits fort, wie zuvor beschrieben oder wie in den Anweisungen des Herstellers^{beschrieben 84,85}.
3. Kompartimentspezifische Durchflusszytometrie.
   1. Entfernen Sie die Assembloide mit einer Schere von den Klammern.
   2. OPTIONAL: Verwenden Sie die Pinzette, um die Kernexplantate vom extrinsischen Hydrogel-Kompartiment zu trennen.
   3. In 1 ml PBS mit Kollagenase I (3 mg/ml) und Dispase II (4 mg/ml) für 4 h bei 37 °C unter ständigem Rühren aufschließen.
   4. Die aufgeschlossene Lösung wird bei 500 x g 5 min bei RT zentrifugiert und der Überstand abgesaugt.
   5. Resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl FACS-Puffer (1 % FBS in PBS) mit den Fluorophor-konjugierten Antikörpern Ihrer Wahl. Eine Auswahl von funktionierenden Fluorophor-konjugierten Antikörpern wurde bereits beschrieben^84,85.
   6. Inkubieren Sie die Färbelösung 30 Minuten lang bei RT.
   7. Verdünnen Sie die Färbelösung mit 1,4 ml FACS-Puffer und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 500 x g bei RT.
   8. Resuspendieren Sie das Pellet in 350 μl FACS-Puffer und filtern Sie die Lösung durch eine 100 μm Nylon-Netzsiebkappe, bevor Sie sie mit dem Durchflusszytometer Ihrer Wahl gemäß den Anweisungen des Herstellers analysieren.
4. Analysieren Sie den Überstand.
   1. Ersetzen Sie das Co-Kulturmedium 3 Tage vor der Überstandsentnahme durch serumfreies Co-Kulturmedium.
   2. Führen Sie eine sofortige und verzögerte Analyse des angereicherten, unverdünnten Überstands mit ELISA- (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) und MSD-Assay-Kits (Meso Scale Discovery) durch. Für die verzögerte Analyse lagern Sie den Überstand in 1,5-ml-Kunststoffröhrchen bei -80 °C.
5. Bewerten Sie die mechanischen Eigenschaften der Assembloiden.
   1. Verwenden Sie ein speziell angefertigtes Dehnungsgerät, um mechanische Kräfte aufzubringen und mechanische Eigenschaften zu messen²². Durch die Edelstahl-Passstifte und die Edelstahlschrauben können die Klemmen auch an anderen Spanngeräten befestigt werden.
   2. Da die mechanischen Eigenschaften des Assembloids weitgehend durch die des eingebetteten Kernexplantats ¹⁸ bestimmt werden, werden die mechanischen Eigenschaften des Kernexplantats vor der Einbettung in ein Hydrogel gemessen, um das Risiko einer Zerstörung des frisch gegossenen Hydrogels während des Messvorgangs zu verringern.

Ergebnisse

Komponentenisolierung (Abbildung 1 und Abbildung 2)
Vor der Verwendung der Kernexplantate und Zellpopulationen in Assembloid-Co-Kultur sind diese Komponenten unter dem Mikroskop zu überprüfen (Abbildung 1). Kernexplantate sollten einen einheitlichen Durchmesser (100-200 μm) und keine sichtbaren Knicke oder Falten aufweisen. Endothelzellen sollten in Kontakt mit anderen Zellen eine längliche Form aufweisen, was sie nicht tun, wenn sie aufgrund einer geringen Anfangsausbeute aus der Isolierung in einer zu geringen Dichte ausgesät werden. In diesem Fall nehmen die Endothelzellen eine rundlichere Form mit Zytoskeletterweiterungen an und vermehren sich deutlich langsamer. Teilen Sie sie nach 7-10 Tagen 1:5 auf. Sehnenfibroblasten, die aus den Achillessehnen isoliert wurden, nehmen im Vergleich zu ihren menschlichen Gegenstücken innerhalb von 1-2 Passagen (jeweils 10-14 Tagen) eine rundlichere Morphologie an, wenn sie 1:6 geteilt wurden. Makrophagen sind viel kleiner als Fibroblasten oder Endothelzellen und vermehren sich nach der Isolierung nicht. Je nach Charge kann ihre Form von pyramidenförmig bis rund variieren.

Die Phänotypen der zellulären Komponenten wurden mit Durchflusszytometrie verifiziert. Ein konjugierter CD31-Antikörper wurde als Marker für Endothelzellen verwendet (Abbildung 2A). Bei der Einstellung der Fluoreszenzschwelle auf der Grundlage einer ungefärbten Kontrollprobe (grau) wurden 90,1 % der Endothelzellen der Passage 1 (P1) und 48,7 % der Endothelzellen der Passage 2 (P2) als CD31-positiv identifiziert. Zur Charakterisierung der Sehnenfibroblasten wurde eine genetisch veränderte Mauslinie verwendet, die den Sehnenfibroblastenmarker Skleraxis zusammen mit einem grün fluoreszierenden Protein (ScxGFP) und einem konjugierten CD146-Antikörper koexprimiert (Abbildung 2B)^35,60. Nach einer Passage (P1) waren 37,3 % der Fibroblasten ScxGFP⁺CD146^-, 0,2 % ScxGFP⁺CD146⁺, 4,3 % ScxGFP-CD146⁺ und 58 % ScxGFP-CD146^-. Nach zwei Passagen (P2) sank der Prozentsatz der ScxGFP⁺CD146-Zellen auf 27,6 %, der Prozentsatz der ScxGFP⁺CD146⁺-Zellen stieg auf 6,9 %, der Prozentsatz der ScxGFP-CD146⁺-Zellen stieg auf 10,6 % und der Prozentsatz der ScxGFP-CD146-Zellen sank auf 54,9 %. Zur Identifizierung und Charakterisierung der Makrophagen wurde ein F4/80-Antikörper in Kombination mit einem CD86- und einem CD206-Antikörper verwendet (Abbildung 2C). Nach Isolierung und Kultivierung waren 96,4 % der aus dem Knochenmark stammenden Zellen F4/80-positiv. Von diesen F4/80-positiven Zellen waren 8,6 % CD206⁺CD86^-, 23,6 % CD206⁺CD86⁺, 28,3 % CD206-CD86⁺ und 39,4 % CD206-CD86^-. Die Kollagenvernetzungsgeschwindigkeit kann von Charge zu Charge variieren und muss vor Beginn der Experimente getestet werden.

Erscheinungsbild des Assembloids (Abbildung 3)
Unter läsionsähnlichen Kulturbedingungen (36 °C, 20 % O₂) blieb das Kernexplantat mechanisch dehnbar, veränderte sein Aussehen nicht und war über mindestens 21 Tage weiterhin visuell unterscheidbar und physikalisch vom umgebenden Hydrogel trennbar (Abbildung 3A,B). Das umgebende Hydrogel wurde im Laufe der Zeit verdichtet, wobei die Verdichtungsgeschwindigkeit von der darin ausgesäten Zellpopulation abhing. Achillessehnen-abgeleitete Fibroblasten zogen ihr umgebendes Hydrogel am schnellsten zusammen und taten dies radial, wenn sie sich in einem Hydrogel befanden, das um ein Kernexplantat gegossen wurde, und in alle Richtungen, wenn dies nicht der Fall war (Abbildung 3B, C). Zunächst verdichteten sich auch zellfreie Hydrogele, die um ein Kernexplantat gelegt wurden. Diese Kontraktion wurde wahrscheinlich durch migrierende Zellen aus dem Kernexplantat verursacht, was auf eine dynamische kompartimentübergreifende Schnittstelle hinweist. Da zellfreie Hydrogele ohne eingebettetes Kernexplantat nicht nachweisbar verdichteten, scheint der Beitrag der durch Wasserverlust verursachten Schrumpfung vernachlässigbar zu sein (Abbildung 3B und Zusatzdatei 6).

Eine fehlende Hydrogelverdichtung kann daher genutzt werden, um Fehler in der Assembloidanordnung (d. h. niedrige Zellkonzentrationen) zu erkennen, und sollte überprüft werden, bevor mit teureren Auslesemethoden fortgefahren wird. Bei der Etablierung dieser Methode gehörten zu den häufigen Fehlern bei der Reduzierung der Zellkonzentration das Sterben von Zellen im extrinsischen Hydrogel, weil sie zu lange in der relativ harten Vernetzungslösung (hoher pH-Wert, niedrige Temperatur) belassen wurden, und das Trocknen von Kernexplantaten, weil die Zeit zwischen mittlerer Aspiration und Hydrogelinjektion zu lang war, oder weil das Kernexplantat zu hoch eingespannt war, um in das Kollagen eingebettet zu werden.

Konfokale Fluoreszenzmikroskopie: Viabilitäts- und Morphologieanalyse (Abbildung 3)
Nach dem Entfernen von den Klemmen mit einer Schere (Abbildung 3B) können Assembloide mit einem konfokalen Mikroskop als Ganzes fixiert, gefärbt und abgebildet werden, ohne dass sie geschnitten werden müssen. Hier wurden Kern // Endothelzelle, Kern // Makrophage und Kern // Fibroblasten-Assembloide mit DAPI (NucBlue) und Ethidium Homodimer (EthD-1) gefärbt, um die Lebensfähigkeit zu analysieren, und DAPI und F-Aktin, um die Morphologie und Zellausbreitung im 3D-Kollagen-Hydrogel zu analysieren (Abbildung 3D). Die Lebensfähigkeit von Kern-// Endothelzell-Assembloiden (Abbildung 3E) wurde quantifiziert und erwies sich nach dem Assembloid-Assembloid im Allgemeinen als zuvor für Kern-/Makrophagen- und Kern-// Fibroblasten-Assembloide^{berichtet 84}. Die Lebensfähigkeit blieb jedoch während der Assembloidkultur bis mindestens Tag 7 stabil.

Mechanisch induzierte Mikroschädigung und Messung mechanischer Eigenschaften (Abbildung 4)
Die an den Klemmhaltern angebrachten Schrauben und Stifte ermöglichen die Fixierung von eingespannten Assembloiden an einachsigen Streckvorrichtungen. Die hier verwendete maßgeschneiderte Streckvorrichtung ist mit einer 10-N-Wägezelle ausgestattet und wurde in früheren Veröffentlichungen beschrieben (Abbildung 4A)²². Alle Proben wurden vor den Messungen mit fünf Dehnungszyklen auf 1 % Dehnung vorkonditioniert.

Die Aufzeichnung der vollständigen Spannungs-Dehnungs-Kurve von Kernexplantaten oder Assembloiden (Abbildung 4B) würde die Quantifizierung des linearen Elastizitätsmoduls (α), der maximalen Spannung (β) und der maximalen Dehnung (у) ermöglichen. Es wird jedoch auch das Kernexplantat oder das Assembloid irreversibel beschädigt, was es unmöglich macht, die Längsentwicklung der maximalen Spannung (β) und der maximalen Dehnung (у) für dieselben Proben zu beurteilen (Abbildung 4B). Hier wurde der lineare Elastizitätsmodul als Maß für die Fähigkeit der Probe verwendet, Kräften standzuhalten, da diese Messung eine Dehnung der Probe auf nur 2 % Dehnung erfordert, was zuvor gezeigt wurde, dass es keine dauerhafte Verringerung des linearen Elastizitätsmoduls¹⁸ verursacht. Insbesondere wurden Kern-// Endothelzell-Assembloide dem Klemmverfahren einer Dehnung von 2 % (ungefähr am Ende des linearen elastischen Bereichs) oder 6 % Dehnung (ungefähr der maximalen Dehnung) ausgesetzt. Die resultierende Mikroschädigung wurde durch Messung des linearen Elastizitätsmoduls vor und nach dem Eingriff bewertet (Abbildung 4C).

In Übereinstimmung mit früheren Experimenten mit monokultivierten Kernexplantaten behielten Kern-// Endothelzell-Assembloide ihren linearen Elastizitätsmodul für mindestens 14 Tage, wenn sie unter quasi-homöostatischen Nischenbedingungen (29 °C, 3 % O₂) kultiviert und Stämmen von nicht mehr als 2 % ausgesetzt ^wurden18,21. In Bezug auf die mechanische Basislinienstimulation schien die statische Dehnung, die durch die Klemmen ausgeübt wurde, die nativen Dehnungsniveaus von Sehnenkerneinheiten in vivo ausreichend nachzuahmen, um katabole Prozesse zu verhindern, die im Allgemeinen mit der Matrixentlastung verbunden sind⁸⁷. Tatsächlich könnte der fortschreitende und statistisch signifikante Rückgang des linearen Elastizitätsmoduls, der in Kern-// Endothelzell-Assembloiden beobachtet wurde, die einer Dehnung von 6% ausgesetzt waren, auf die Matrixentlastung zurückgeführt werden, die auf mechanisch induzierte Matrix-Mikroschäden zurückzuführen ist.

Bei der Durchführung dieser Experimente ist es wichtig, das Austrocknen des Assembloids zu verhindern. Hier wurden sie in autoklaviertes und benetztes Papier eingeschlossen, aber je nach Kompatibilität mit der verwendeten Streckvorrichtung könnten auch andere Methoden praktikabel sein. Da die Reibung zwischen den Metallklemmen und dem Kernexplantat begrenzt ist, legen Sie während des Klemmens kleine Papierstücke zwischen das Metall und das Kernexplantat, um ein Verrutschen zu verhindern, und überwachen Sie den Streckprozess genau, um verrutschte Kernexplantate und Assembloide zu erkennen und auszuschließen.

Kompartimentspezifische Transkriptom- und Assembloid-spezifische Sekretomanalyse (Abbildung 5 und Abbildung 6)
In der ersten Reihe von Kern-Monokulturexperimenten, die hier vorgestellt werden, wurde die Stabilität der Kerngenexpression nach der Explantatisolierung untersucht, um die Isolierung von experimentellen Effekten zu entkoppeln (Abbildung 5A). Obwohl höhere Replikatzahlen für präzise Schlussfolgerungen erforderlich sind, stieg die Expression von Vegfa und Mmps in frisch isolierten Kernexplantaten innerhalb von Stunden nach der Explantatisolierung stark an, wenn sie unter läsionsähnlichen Nischenbedingungen kultiviert wurden (37 °C, 20% O₂).

Neovaskularisation ist ein zentrales Kennzeichen von Sehnenerkrankungen und -reparaturen, die zum Teil durch Endothelzellen angetrieben werden könnten, die durch pro-angiogene Faktoren (d. h. vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor, Vegfa) aktiviert werden, die vom Sehnenkern unter Hypoxie⁸⁸ sezerniert werden. Bei der Untersuchung des ersten Schritts dieses potenziellen Crosstalks (Abbildung 5B) wurde festgestellt, dass die Expression sowohl von Vegfa als auch des Hypoxiemarkers Carboanhydrase 9 (Ca9) in monokultivierten Explantaten unter niedriger Sauerstoffspannung (3% O₂) statistisch signifikant erhöht war, im Gegensatz zu solchen, die unter hoher Sauerstoffspannung monokultiviert wurden (20% O₂). In der Zwischenzeit schien die niedrigere Sauerstoffspannung keine Veränderungen in der Expression von Sehnenfibroblastenmarkern wie Skleraxis (Scx) und Kollagen-1 (Col1a1) zu verursachen. Zusammengenommen identifizieren diese Ergebnisse kernresidente Zellen als plausible Beiträge zur pro-angiogenen Signalübertragung in einer hypoxischen Nische.

Als nächstes wurde die Aktivierung von Endothelzellen durch pro-angiogene Kernsignale in der Kern-// Endothelzell-Assembloid-Co-Kultur unter hoher (20% O₂) und niedriger (3% O₂) Sauerstoffspannung untersucht. Glücklicherweise ermöglicht die modulare Zusammensetzung der Assembloide eine kompartimentspezifische Transkriptomanalyse nach der Kultur, indem das Kernexplantat physikalisch vom extrinsischen Kollagenhydrogel getrennt wird (Abbildung 6A). Im Kernexplantat (Abbildung 6D) wurde erneut bestätigt, dass die Vegfa-Expression bei niedriger Sauerstoffspannung zunimmt, obwohl die Wirkung auf andere hypoxische Marker wie Fgf2 weniger klar war und höhere Replikatzahlen für präzise Schlussfolgerungen erfordert. Darüber hinaus war die Expression von proinflammatorischen Markern wie Tnf-α und Markern für den Abbau der extrazellulären Matrix wie Mmp3 im Kern bei niedriger Sauerstoffspannung verringert. In dem extrinsischen Hydrogel, das ursprünglich mit Endothelzellen besiedelt war (Abbildung 6E), verringerte das Vorhandensein eines lebenden Kernexplantats (aC) die Vegfa-Expression bei niedriger Sauerstoffspannung, aber nicht bei hoher Sauerstoffspannung. Darüber hinaus verringerte das Vorhandensein eines devitalisierten (dC) Kernexplantats unter niedriger Sauerstoffspannung auch nicht die Vegfa-Expression . Unter niedriger Sauerstoffspannung war die Tnf-α-Expression im extrinsischen Hydrogel um aC/dC vergleichbar, stieg aber unter hoher Sauerstoffspannung um lebende Kernexplantate an. Die Fgf2-Expression war unter allen Bedingungen im Vergleich zu dem extrinsischen endothelzellbeladenen Hydrogel, das um ein devitalisiertes Kernexplantat unter hoher Sauerstoffspannung, aber die meisten unter niedriger Sauerstoffspannung kultiviert wurde, verringert. Die Mmp3-Expression war bei lebenden Kernexplantaten unter hoher Sauerstoffspannung am höchsten und bei devitalisierten Kernexplantaten bei niedriger Sauerstoffspannung am niedrigsten. Insgesamt scheinen die co-kultivierten Endothelzellen sowohl auf das aktive Kernexplantat zu reagieren, das in der Lage ist, Crosstalk als auch Schwankungen des Sauerstoffgehalts zu initiieren. Eine umfassendere Transkriptomanalyse würde die Aufklärung ihrer jeweiligen Beiträge erleichtern.

Die Modularität des assembloiden Systems ermöglicht die Integration von gentechnisch veränderten Zellen, die fluoreszierende Reportergene enthalten. Hier wurden Endothelzellen, die aus Pdgfb-iCreER-mG-Mäusen⁸⁹ isoliert wurden, in das Hydrogelkompartiment ausgesät. Diese Zellen koexprimieren den Endothelzellmarker, den plättchenabgeleiteten Wachstumsfaktor-Untereinheit b (Pdgfb) zusammen mit dem verstärkten grün fluoreszierenden Protein (EGFP), das Pdgfb-exprimierende Endothelzellen unter der Mikroskopie grün erscheinen lässt (Abbildung 6C). Mit dieser Methode wurde bestätigt, dass das Vorhandensein von Pdgfb-exprimierenden Endothelzellen über 7 Tage in Kultur (37 °C) aufrechterhalten wurde und unabhängig von der Sauerstoffspannung zu sein schien (20% O₂ im Vergleich zu 3% O₂).

Um das Sekretom von Assembloiden zu analysieren, wurde das Kulturmedium, das jeweils für die Co-Kultur der Kern- und Kern-Fibroblasten, des Kerns // Makrophagen oder des Kerns // Endothelzellen verwendet wurde, drei Tage vor dem Aspirieren und Einfrieren des nun mit dem Sekretom angereicherten Überstands durch sein serumfreies Gegenstück ersetzt (Abbildung 6A). Diese Anreicherungszeit war ausreichend, um Zytokine wie den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) mit einem MSD-Assay nachzuweisen, wie hier für Core-Explantate und Core-// Fibroblasten-Assembloide gezeigt, die unter läsionsähnlichen Nischenbedingungen kultiviert wurden (Abbildung 6B).

Wichtige Überlegungen bei der Analyse der Sekretome und Transkriptome von Kernexplantaten und Assembloiden betreffen die Verwendung geeigneter Kontrollen. Frisch isolierte Kernexplantate haben einen begrenzten Wert, da insbesondere ihre Expression von Vegfa und Mmps innerhalb von Stunden nach der Isolierung stark ansteigt (Abbildung 5A). Zeitlich angepasste Explantate, die von einem zunächst zellfreien Hydrogel umgeben sind, eignen sich besser als Kontrollen für die Genexpression des Kernkompartiments. Für das extrinsische Hydrogel sind zellbeladene Hydrogele, die ohne Kernexplantat kultiviert werden, minderwertige Kontrollen im Vergleich zu zellbeladenen Hydrogelen, die um devitalisierte Kernexplantate kultiviert werden (Ergänzungsdatei 7), hauptsächlich weil sie sich zu rundlichen Formen verdichten, anstatt zu länglichen Hydrogelen, was die Zellmorphologie stark verändert (Abbildung 3A).

Abbildung 1: Isolierung und Montage von Assembloidkomponenten zum Modellieren des In-vivo-Übersprechens . Sehnenkernexplantate wurden aus Mäuseschwänzen extrahiert, geschnitten und geklemmt. Die Beinmuskeln der Maus (d. h. Quadrizeps femoris (QF), Gastrocnemius (G) und Tibialis anterior (TA)) wurden verdaut, um Endothelzellen zu isolieren, die dann auf Gewebekulturkunststoff kultiviert wurden. Die Achillessehnen (AT) wurden ebenfalls verdaut, um Sehnenfibroblasten zu isolieren, die dann auf Gewebekulturplastik kultiviert wurden. Das Knochenmark aus dem Schienbein und dem Oberschenkelknochen wurde aus den Knochen gespült. Anschließend wurden die isolierten Monozyten auf Gewebekulturkunststoff kultiviert und zu naiven Makrophagen differenziert. Die lichtmikroskopischen Aufnahmen (10x) zeigen das Aussehen von Kernexplantaten, Endothelzellen, Sehnenfibroblasten und Makrophagen unmittelbar vor ihrer Integration in Assembloide. Während der Assemblierung wurden die auf Kunststoff kultivierten Zellen in Suspension gebracht und dann in eine Kollagen-1-Lösung (1,6 mg/ml) ausgesät. Dann wurde die Zell-Hydrogel-Mischung um das geklemmte Kernexplantat gegossen und 50 Minuten lang bei 37 °C polymerisiert, bevor Kulturmedium hinzugefügt wurde. Die Kulturbedingungen wurden über die Klemmen (mechanische Spannung) und die Inkubatoreinstellungen (Sauerstoffkonzentration, Temperatur) gesteuert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Charakterisierung zellulärer Assembloidkomponenten. (A) Repräsentative durchflusszytometrische Analyse von Muskel-Endothelzellen nach einer Passage (P1, obere Reihe) und zwei Passagen (P2, untere Reihe). Die Zählungen für ungefärbte (grau) und CD31-gefärbte (grüne) Zellen wurden auf modal normalisiert. Die Prozentsätze sind für die CD31-gefärbte Gruppe angegeben. (B) Repräsentative durchflusszytometrische Analyse von Achillessehnen-abgeleiteten Fibroblasten nach einer Passage (P1, obere Reihe) und zwei Passagen (P2, untere Reihe). Die Achsen zeigen Fluoreszenzintensitäten von ungefärbten Zellen (grau) und Zellen, die sowohl ScxGFP exprimieren als auch mit CD146-Antikörpern (Regenbogenfarben) gefärbt sind. (C) Repräsentative durchflusszytometrische Analyse von Makrophagen aus dem Knochenmark nach der Kultur. In der oberen Reihe wurden die Zählungen für ungefärbte (grau) und F4/80-gefärbte (grün) Zellen auf modal normalisiert. Die Prozentsätze sind für die F4/80-gefärbte Gruppe angegeben. Die Grafik in der unteren Zeile zeigt die Fluoreszenzintensitäten von ungefärbten Zellen (grau) und der F4/80⁺ -Untergruppe von Zellen, die mit CD206-Antikörpern und CD86-Antikörpern gefärbt sind (Regenbogenfarben). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Assembloide Bildgebung und Aussehen. (A) Repräsentative Fotos, die an Tag 0 (d0) und Tag 21 (d21) der Kultur (37 °C, 20 % O₂) aufgenommen wurden, zeigen eine mehrdimensionale Kontraktion eines Hydrogels mit extrinsischen Fibroblasten ohne eingebettetes Kernexplantat und eine starke radiale Verdichtung eines Hydrogels mit extrinsischen Fibroblasten um ein Kernexplantat. (B) Repräsentative Fotos, die am Tag 21 (d21) der Kultur (37 °C, 20 %_O2) aufgenommen wurden, zeigen Unterschiede in der Verdichtungsgeschwindigkeit zwischen zellfreien Hydrogelen, zellfreien Hydrogelen, die um ein Kernexplantat gegossen werden, und Sehnenfibroblasten-beladenen Hydrogelen, die um ein Kernexplantat gegossen werden. (C) Die repräsentativen lichtmikroskopischen Aufnahmen (10x), die an Tag 0 (d0) und Tag 21 (d21) der Kultur (37 °C, 20 % O₂) aufgenommen wurden, zeigen Längsveränderungen des Vorhandenseins von Zellpopulationen und der Verdichtungsgeschwindigkeit des Kollagenhydrogels (HG) um das Kernexplantat (E) im Kern // zellfrei und Kern // Fibroblasten-Assembloid-Cokultur. Die schematische Darstellung zeigt die Unterschiede in der Hydrogelverdichtung zwischen Kern // zellfreiem Assembloid und Kern // Fibroblasten-Assembloid-Cokultur. (D) Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder, die an Tag 7 (d7) der Kern-/Endothelzelle, des Kerns // Makrophagen und des Kerns // Fibroblasten-Assembloid-Co-Kultur (37 °C, 20 % O₂) aufgenommen wurden. Die Bilder in der linken Reihe zeigen Assembloide mit blau gefärbten Zellkernen (DAPI) und toten Zellen in rosa (Ethidium-Homodimer-1). Die anderen beiden Reihen zeigen Assembloide mit blau gefärbten Zellkernen (DAPI) und Aktinfilamenten in grün (F-Aktin). (E) Boxplots, die die quantifizierte Lebensfähigkeit von Kern-// Endothelzell-Assembloiden am Tag 1 (d1) und Tag 7 (d7) der Co-Kultur darstellen. N = 5. Das obere und untere Scharnier entsprechen dem ersten und dritten Quartil (25^. und 75^. Perzentil) und das mittlere dem Median. Whisker erstrecken sich vom oberen/unteren Scharnier bis zum größten/kleinsten Wert nicht weiter als das 1,5-fache des Interquartilsabstands. P-Werte: ^n.s.p > 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Mechanische Stimulation von Assembloiden und Messung der mechanischen Eigenschaften von Assembloiden. (A) Grafische Darstellung der speziell angefertigten Dehnungsvorrichtung, die die Klemmhalterplattformen, einen Kraftsensor und einen Schrittmotor umfasst. Das fotografische Bild zeigt ein Assembloid, das mit Klammern an der Streckvorrichtung befestigt ist. Der Deckel eines 15-ml-Kunststoffröhrchens (Ø: 17 mm) für die Waage. (B) Diagramm mit repräsentativen Spannungs-/Dehnungskurven für Kernexplantate (hellblau) und Assembloide (hellrot). Der lineare Elastizitätsmodul (α), die maximale Spannung (β) und die maximale Dehnung (у) können aus den Daten extrahiert werden, um das Kernexplantat oder Assembloid mechanisch zu charakterisieren. (C) Diagramm, das den linearen Elastizitätsmodul (Emod) von Kern-// Endothelzell-Assembloiden zeigt, die über einen Zeitraum von 14 Tagen kokultiviert wurden (29 °C, 3 % O₂), nachdem sie zu Beginn des Versuchs geklemmt (durchgezogene Linie), geklemmt und auf 2 % L_0-Dehnung (gestrichelte Linie) oder auf 6 % L_0-Dehnung (gestrichelte Linie) geklemmt und gedehnt wurden. N = 5. Die Datenpunkte wurden vor der Streckung auf den linearen Elastizitätsmodul des Anfangsmoduls normalisiert und werden alle als Mittelwert (±rem) angezeigt. P-Werte: *p < 0,05, **p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Veränderungen des Kerntranskriptoms nach Isolierung und Kultivierung unter verschiedenen Nischenbedingungen. (A) Streudiagramm, das die Faltenänderungen in der Genexpression von Vegfa, Mmp13 und Mmp3 in monokultivierten (37 °C, 20% O₂) murinen Kernexplantaten 2 h, 4 h, 6 h und 8 h nach der Isolierung vom Schwanz zeigt. Die Faltenveränderungen zu den jeweiligen Zeitpunkten wurden 2 Stunden nach der Isolierung auf die Genexpression normalisiert. N = 2. (B) Boxplots, die die Faltenänderungen in der Ca9-, Vegfa-, Scx- und Col1a1-Genexpression in Kernexplantaten darstellen, die unter niedriger Sauerstoffspannung (3% O₂) monokultiviert wurden, normalisiert und mit monokultivierten Explantaten unter hoher Sauerstoffspannung (20% O₂) verglichen. N = 5-6. Das obere und untere Scharnier der Boxplots entsprechen dem ersten und dritten Quartil (25^. und 75^. Perzentil) und das mittlere dem Median. Whisker erstrecken sich vom oberen/unteren Scharnier bis zum größten/kleinsten Wert nicht weiter als das 1,5-fache des Interquartilsabstands. Für die Normalisierung verwendete Datenpunkte werden als schwarze Punkte und einzelne Datenpunkte als rote Punkte dargestellt. P-Werte: **p < 0,01, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Assembloid-spezifisches Sekretom und kompartimentspezifische Transkriptomanalyse. (A) Repräsentatives Foto, das das Assembloid an Tag 7 (d7) zeigt, als Sekretom- und Transkriptomproben entnommen wurden, und Darstellung des zugrunde liegenden Arbeitsablaufs. (B) VEGF-Konzentration (pg/ml) im Überstand von Kern- und Kern-Fibroblasten-Assembloiden nach 7 Tagen Co-Kultur (37 °C, 20 % O₂), dargestellt als Boxplots. N = 6. (C) Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder von Kern-// Endothelzellassembloiden nach 7 Tagen Co-Kultur (37 °C) unter hoher Sauerstoffspannung (20% O₂) und niedriger Sauerstoffspannung (3% O₂). Die Zellkerne sind blau gefärbt (DAPI), und die eingebetteten Endothelzellen exprimieren zusammen mit dem Endothelzellmarker-Thrombozyten-abgeleitete Wachstumsfaktor-Untereinheit b (Pdgfb) ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (EGFP). Die gestrichelte Linie zeigt die kompartimentelle Grenzfläche zwischen dem Kernexplantat (E) und dem endothelzellbeladenen Hydrogel (HG). (D) Streudiagramm, das die Faltungsänderungen in der Vegfa-, Tnf-α-, Fgf2- und Mmp3-Genexpression im Kernkompartiment von Kern-// Endothelzell-Assembloiden, die unter niedriger Sauerstoffspannung (3% O₂) kokultiviert wurden, normalisiert und mit denen verglichen werden, die unter hoher Sauerstoffspannung (20% O₂) kultiviert wurden. N = 2. (E) Streudiagramm, das die Faltungsänderungen in der Genexpression von Vegfa, Tnf-α, Fgf2 und Mmp3 im extrinsischen Kompartiment von Kern // Endothelzellassembloiden mit einem lebenden Kern (aC) oder einem devitalisierten Kern (dC) darstellt, die unter hoher Sauerstoffspannung (20% O₂) und niedriger Sauerstoffspannung (3% O₂) kokultiviert wurden). Die Faltenänderungen unter den jeweiligen Bedingungen wurden auf das extrinsische Kompartiment eines Kerns // Endothelzellassembloids mit einem devitalisierten Kern (dC) normalisiert, der unter hoher Sauerstoffspannung (20% O₂) cokultiviert wurde. N = 3-4. In B entsprechen das obere und untere Scharnier der Boxplots dem ersten und dritten Quartil (25^. und 75^. Perzentil) und das mittlere dem Median. Whisker erstrecken sich vom oberen/unteren Scharnier bis zum größten/kleinsten Wert, nicht weiter als das 1,5-fache des Interquartilsabstands. Ausreißer werden als schwarze Punkte dargestellt. P-Werte: *p < 0,05. In D und E werden die für die Normalisierung verwendeten Datenpunkte als schwarze Punkte und einzelne Datenpunkte als rote Punkte dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Inputanforderungen für Modellsysteme für Sehnenerkrankungen und Verletzungen. Eine Liste von primären Auslösern und sekundären Treibern, die mit einer Auswahl von Eingabeparametern abgeglichen werden, deren Handhabbarkeit für die Modellierung von Sehnenerkrankungen und -verletzungen von zentraler Bedeutung ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Output-Anforderungen für Modellsysteme für Sehnenerkrankungen und Verletzungen. Eine Auswahl von Merkmalen für Sehnenerkrankungen, die mit einer Auswahl von Ausgabeparametern abgeglichen sind, deren Quantifizierbarkeit für die Interpretation des Modellverhaltens von Sehnenerkrankungen und Verletzungen von zentraler Bedeutung ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: .stl-Datei für die Klemmhalter, die Montagestation und die Kammerformen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 2: Plan des rechten Klemmhalters. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 3: Plan des linken Klemmhalters. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: Plan der Montageplattform Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 5: Plan der Metallklammern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 6: Bild, das die Schrumpfung des zellfreien Hydrogels zeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 7: Bild zeigt ein devitalisiertes Kernexplantat. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Insgesamt hat das hier vorgestellte Assembloid-Modellsystem mehrere kritische Schritte, die hervorgehoben werden müssen. Erstens ist das Modellsystem nur so gut wie die Qualität seiner Komponenten. Es ist wichtig, das Kernexplantat und die zu säenden Zellpopulationen vor Beginn des Assemblierungsprozesses unter dem Mikroskop zu überprüfen. Ebenso wichtig ist es, den Phänotyp der isolierten Zellpopulationen mindestens einmal mit Durchflusszytometrie zu überprüfen. Gerade wenn eine neue Charge von Kollagen-1 zum ersten Mal verwendet wird, ist es von Vorteil, die Vernetzungsgeschwindigkeit in einem Probelauf zu überprüfen, bevor Zellen darin eingebettet werden. Die Assembloid-Baugruppe erfordert viel manuelle Handhabung, was das Infektionsrisiko erhöht. Um das Infektionsrisiko zu minimieren, arbeiten Sie in einer sterilen Biosicherheitshaube mit laminarem Luftstrom, wechseln Sie häufig die Handschuhe und dekontaminieren Sie die Handschuhe sowie den Arbeitsbereich mit 80% Ethanol. Verwenden Sie aus ähnlichen Gründen die 3D-gedruckten Klemmhalter nicht mehr als einmal. Vor dem eigentlichen Einbettungsprozess ist es wichtig, alle Hydrogelkomponenten (Vernetzungslösung, Kollagen-1-Lösung) auf Eis zu halten, um eine vorzeitige Vernetzung zu verhindern. Folglich muss man schnell arbeiten, sobald die Zellen der Vernetzungslösung zugesetzt werden, um den Zelltod aufgrund des hohen pH-Werts und der niedrigen Temperatur der Vernetzungslösung zu begrenzen. Um einen trocknungsbedingten Zelltod im Kernexplantat zu verhindern, aspirieren Sie das Medium, das die geklemmten Kernexplantate bedeckt, unmittelbar vor dem Mischen der Vernetzungslösung mit der Kollagen-1-Lösung. Um die zentrale Platzierung des Kernexplantats innerhalb des Hydrogels zu gewährleisten, ist es ideal, das Hydrogel um ein geklemmtes Kernexplantat zu gießen, das leicht gespannt ist. Befestigen Sie dazu mit dem Passstift und der Bolzenschraube M3 x 16 mm die Klemmhalter an einem (3D-gedruckten) Plattensatz mit Löchern in den entsprechenden Längen. Nach der 50-minütigen Polymerisationszeit kann das eingebettete Kernexplantat je nach gewünschten Kulturbedingungen wieder abgespannt werden. Die Menge an Spannung, die das Assembloid während der Kultur erfährt, hat einen tiefgreifenden Einfluss auf die experimentellen Ergebnisse und muss über Proben und Bedingungen hinweg einheitlich gehalten werden²¹.

Nichtsdestotrotz ist der große Einfluss der mechanischen (Ent-)Beladung auf die experimentellen Ergebnisse ein Hauptvorteil des Assembloid-Modells gegenüber den meisten Tissue-Engineering-Alternativen, zumal die beibehaltene Matrixzusammensetzung des Kernexplantats auch die komplexen In-vivo-Beladungsmuster auf zellulärer Ebene nachbilden^{sollte 90}. Während in der Praxis bisher nur die Messung des linearen Elastizitätsmoduls, der maximalen Zugdehnung und der maximalen Zugspannung von Assembloiden demonstriert wurde, wurden an anderer Stelle Protokolle für Ermüdungsfestigkeits- und Spannungsrelaxationsmessungen für Sehnenkernexplantate beschrieben und sollten auf die Assembloide^91,92 anwendbar sein. Neben den In-vivo-ähnlichen Belastungsmustern ist die mehrstufige Modularität des Assembloids wahrscheinlich sein größter Vorteil. Dank der einzelnen Kulturkammern kann für jede Probe separat ein kontrollierbarer Satz von Nischenbedingungen eingestellt werden (d. h. Temperatur, Sauerstoffspannung, Glukosekonzentration, Supplementierung, Stimulatoren, Inhibitoren und statische Dehnung mit einer Platte). Als nächstes sind die Matrixsteifigkeit und die Matrixzusammensetzung des extrinsischen Kompartiments durch die Hydrogelzusammensetzung anpassbar und würden es beispielsweise ermöglichen, die Auswirkungen einer zunehmend erkrankten Gewebemikroumgebung zu untersuchen, indem mehr Kollagen-3 und zelluläres Fibronektin 93,94,95 eingebaut werden. Die bewerteten Zellpopulationen im extrinsischen Kompartiment sind leicht anpassbar, indem sie auswählen, welche Zellen ausgesät werden sollen, können aber auch im Sehnenkernexplantat modifiziert werden, indem etablierte genetisch veränderte Zelllinien und Mauslinien genutzt werden (d. h. ScxLin-Zellverarmung)⁹⁶. Die unterschiedliche Matrix- und Zellzusammensetzung der beiden Kompartimente sorgt außerdem für eine einzigartige kompartimentierte 3D-Struktur, die ein weiteres Kennzeichen der zentralen Sehne^{ist 1,30,46}.

Bei der Verwendung dieses Systems ist es wichtig, die Konsequenzen der Modularität des Systems für die Granularität der Ergebnisparameter zu berücksichtigen. Während die Zellproliferation und -rekrutierung für jedes Kompartiment separat beurteilt werden können, sind die mechanischen Eigenschaften, Sekretomkomponenten und Abbauprodukte derzeit nur für das gesamte Assembloid messbar. Was den Durchsatz betrifft, so kann eine entsprechend geschulte Person an einem normalen Arbeitstag bis zu 50 Assembloide vorbereiten, wobei der Hauptengpass der Spannvorgang ist. Während sich einige der Auslesemethoden gegenseitig ausschließen, ist es möglich, mechanische Eigenschaften und Sekretomkomponenten wiederholt an derselben Probe sowie entweder die Zellpopulationszusammensetzung (Durchflusszytometrie), das Zelltranskriptom (RT-qPCR, RNA-Sequenzierung) oder die Matrix- und Zellverteilung (Immunzytochemie/Fluoreszenzmikroskopie) an Endpunkten zu bewerten. In früheren Veröffentlichungen wurden diese Methoden eingesetzt, um interzelluläre, kompartimentübergreifende Interaktionen in Kern-/Fibroblasten- und Kern-Makrophagen-Assembloiden umfassend zu charakterisieren, die einer läsionsähnlichen Nische ausgesetzt waren^84,85. In dieser Arbeit wurde die Fähigkeit des assembloiden Modellsystems untersucht, das kompartimentübergreifende Zusammenspiel zwischen dem Kern und extrinsischen Endothelzellen unter verschiedenen Mikroumgebungsreizen zu untersuchen.

Die Modularität des Modellsystems ermöglicht eine zukünftige Verfeinerung der Methode, die notwendig ist, um die folgenden Einschränkungen der aktuellen Entwurfsiteration zu überwinden. Die in dieser Arbeit vorgestellte durchflusszytometrische Analyse und die kürzlich veröffentlichten Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten zeigten, dass die Tenozyten im Sehnenkern und die von der Achillessehne abgeleiteten Populationen heterogener sind als bisher angenommen 24,34,59,84,97. Darüber hinaus verwischt das Migrationsverhalten von anfänglich Kern- oder Hydrogel-residenten Zellpopulationen die Assembloid-Kompartimentierung während der Kultur. Beide Faktoren zusammen machen es schwierig, transkriptomische Unterschiede bestimmten Zelltypen zuzuordnen und proliferations- und migrationsbasierte Prozesse zu trennen. Diese Einschränkung könnte durch die Verfeinerung der Eingangspopulation mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) basierend auf der zellulären Zusammensetzung gesunder oder kranker Sehnen, die in neueren In-vivo-Studien charakterisiert wurden, durch die Verbesserung der Auslesung durch die Implementierung einer Einzelzell-RNA-Sequenzierung und die Integration von Proliferationsmarkern wie einer EdU-Färbung (5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin) während der Mikroskopie überwunden werden.

Die hier vorgestellten Assembloide haben auch eine Schwäche mit den meisten der derzeit verfügbaren In-vitro-Systeme, die erkrankte Organe simulieren, die vom Rest des Körpers getrennt sind^98,99. Die hier verwendete kulturkammerbasierte Plattform positioniert das Modellsystem jedoch gut für die Integration in eine Multiorganplattform, auf der Assembloide, die verschiedene Organe nachahmen, miteinander verbunden sind und Wechselwirkungen zwischen Organen untersucht werden können.

Im Kern basiert das Modellsystem auf positionsbezogenen Nagetiersehnen, was zu seinen eigenen einzigartigen Nachteilen führt. Erstens wird die Übertragbarkeit der Ergebnisse dadurch erschwert, dass Wildtyp-Mäuse keine Sehnenerkrankungen entwickeln oder daran leiden ^8.100.101. Die Integration von Geweben und Zellen von Menschen oder neu entwickelten Mausstämmen, die Aspekte von Sehnenerkrankungen aufweisen, könnte dieses Problem lindern¹⁰². Die Umstellung auf ein humanbasiertes Assembloid ist besonders interessant, da es Studien mit patientengewonnenem Gewebe von unterschiedlich erkrankten Sehnen (d. h. Tendinitis, Tendinose oder Peritendinitis) und sogar behandlungsresistenten Spendern ermöglichen würde, die personalisiertere Behandlungsprogramme freischalten könnten. Zweitens können murine Schwanzsehnenexplantate nicht besonders gut mit überlastungsinduzierten Mikroschäden umgehen, was die Anwendbarkeit des Modellsystems für die Untersuchung akuter Sehnenschäden einschränkt.

Aus all diesen Gründen sind Explantat-Hydrogel-Assembloide in einer erstklassigen Position, um die Biologie des Sehnenkerns, die Wechselwirkungen zwischen Matrixstruktur und -funktion und die kompartimentären Wechselwirkungen zwischen bestimmten Zellpopulationen als Reaktion auf nischeninduzierte Mikroschäden zu untersuchen. Die Erkenntnisse aus diesen eher Hochdurchsatzstudien könnten der In-vivo-Forschung und Behandlungsentwicklung eine Richtung geben.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 mm x 25 mm injection needle (G27)	Sterican	9186174
3D printing filament: Clear polylactic acid prusament	Prusa	NA
4% formaldehyde	Roti-Histofix	P087.4
Accutase cell detachment solution	Sigma-Aldrich	A6964-100ML
Amphotericin	VWR	L0009-100
Attachable digital C-mount camera: Moticam 2	Motic	NA
Bolt screw M3 x 16 mm, stainless steel	RS PRO	1871235
Bolt screw M3 x 6 mm, stainless steel	RS PRO	1871207
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
CD146 antibody: PE anti-mouse	BioLegend	134703
CD206 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse	BioLegend	141709
CD31 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse	BioLegend	102413
CD86 antibody: PE anti-mouse	BioLegend	105007
Collagenase I	Thermo Fisher Scientific	17100017
Collagenase IV	Gibco	17104-019
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392-100ML
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	7000183
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G
DMEM/F12	Sigma	7002211
Dowel Pin, 3 mm x 16 mm, stainless steel	Accu	HDP-3-16-A1
Dragon Skin 10 Slow/1 silicone	KauPO	09301-004-000001
Endopan 3 Kit	Pan-Biotech	P04-0010K
Endothelial cell growth supplement	Lonza	CC-3162
Eppendorf safe-lock plastic tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30121023
Ethidium homodimer, EthD-1, 2 mM stock in DMSO	Sigma-Aldrich	46043-1MG-F
F4/80 antibody: Apc/fire 750 anti-mouse	BioLegend	123151
Falcon plastic tube (15 mL)	Corning	352096
Falcon plastic tube (50 mL)	Corning	352070
Flow cytometer: LSR II Fortessa	BD Bioscience	23-11617-02
Gelatin	Invitrogen	D12054
Hellmanex III alkaline cleaning concentrate	Sigma	Z805939-1EA
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Hydroxyproline assay	Sigma-Aldrich	MAK008
Image analysis software: Motic Images Plus 3.0 ML	Motic	NA
L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium Salt n-Hydrate	Wako Chemicals	013-19641
LSE Low Speed Orbital Shaker	Corning	6780-FP
MEM non-essential amino acids	Sigma	7002231
Mouse macrophage-stimulating factor (m-CSF)	PeproTech	315-02-50ug
MSD assay	Mesoscale Discovery	various
NucBlue	Thermo Fisher Scientific	R37605
Nylon mesh strainer cap, 100 µm	Corning	734-2761
Original Prusa i3 MK3S 3D printer	Prusa	i3 MK3S
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate-buffered saline (PBS), ph 7.4, sterile, 10 L	Gibco	10010001
Puromycin	Gibco	A1113803
RBC lysis buffer	VWR	786-650
recombinant m-CSF	PeproTech	315-02
RNA extraction kit: Rneasy plus Micro	Qiagen	74034
Slicing software: PrusaSlicer	Prusa	NA	Version 2.6.0 or higher
Sterile Cell Strainer 100 µm	Fisherbrand	22363549
Surgical scalpel blade No. 21	Swann-Morton	307
Trizol reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Trypsin-EDTA (0.5 %)	Gibco	15400054