Duale extrazelluläre Aufzeichnungen im Hippocampus der Maus und im präfrontalen Kortex

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines speziell entwickelten Aufzeichnungsgeräts und von Elektroden zur Aufzeichnung lokaler Feldpotentiale und zur Untersuchung des Informationsflusses im Hippocampus der Maus und im präfrontalen Kortex.

Zusammenfassung

Die Technik der Aufzeichnung von lokalen Feldpotentialen (LFPs) ist eine elektrophysiologische Methode, mit der die elektrische Aktivität lokalisierter neuronaler Populationen gemessen wird. Es dient als wichtiges Werkzeug in der Kognitionsforschung, insbesondere in Gehirnregionen wie dem Hippocampus und dem präfrontalen Kortex. Duale LFP-Aufnahmen zwischen diesen Bereichen sind von besonderem Interesse, da sie die Erforschung der interregionalen Signalkommunikation ermöglichen. Die Methoden zur Durchführung dieser Aufnahmen werden jedoch selten beschrieben, und die meisten kommerziellen Aufnahmegeräte sind entweder teuer oder nicht anpassungsfähig, um spezifische experimentelle Designs aufzunehmen. Diese Studie stellt ein umfassendes Protokoll für die Durchführung von Doppelelektroden-LFP-Aufzeichnungen im Hippocampus der Maus und im präfrontalen Kortex vor, um die Auswirkungen von Antipsychotika und Kaliumkanalmodulatoren auf die LFP-Eigenschaften in diesen Bereichen zu untersuchen. Die Technik ermöglicht die Messung von LFP-Eigenschaften, einschließlich Leistungsspektren innerhalb jeder Gehirnregion und der Kohärenz zwischen den beiden. Zusätzlich wurde für diese Experimente ein kostengünstiges, speziell angefertigtes Aufzeichnungsgerät entwickelt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Möglichkeit bietet, Signale mit hohen Signal-Rausch-Verhältnissen in verschiedenen Hirnregionen aufzuzeichnen, was die Untersuchung der interregionalen Informationskommunikation innerhalb des Gehirns erleichtert.

Einleitung

Lokale Feldpotentiale (LFPs) beziehen sich auf die elektrische Aktivität, die aus dem extrazellulären Raum aufgezeichnet wird und die kollektive Aktivität einer lokalisierten Gruppe von Neuronen widerspiegelt. Sie weisen einen vielfältigen Frequenzbereich auf, der von langsamen Wellen bei 1 Hz bis hin zu schnellen Schwingungen bei 100 Hz oder 200 Hz reicht. Spezifische Frequenzbänder wurden mit kognitiven Funktionen wie Lernen, Gedächtnis^{und Entscheidungsfindung} in Verbindung gebracht ^1,2. Veränderungen der LFP-Eigenschaften wurden als Biomarker für verschiedene neurologische Erkrankungen, einschließlich Demenz und Schizophrenie, verwendet ^3,4. Die Analyse von LFP-Aufzeichnungen kann wertvolle Einblicke in die zugrunde liegenden pathologischen Mechanismen im Zusammenhang mit diesen Erkrankungen und mögliche therapeutische Strategien bieten.

Die Dual-LFP-Aufzeichnung ist eine Technik, mit der die lokalisierte elektrische Aktivität innerhalb und zwischen zwei bestimmten Gehirnregionen gemessen wird. Diese Technik bietet eine wertvolle Gelegenheit, die komplizierte neuronale Dynamik und Signalkommunikation zu untersuchen, die innerhalb und zwischen verschiedenen Gehirnregionen abläuft. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Erkennung von Veränderungen in den neuronalen Eigenschaften einzelner Hirnregionen komplex sein kann, aber Veränderungen in der interregionalen kortikalen Kommunikation können beobachtet werden ^5,6. Daher bietet die Verwendung von Dual-LFP-Aufnahmen ein wirksames Mittel, um dieses Problem zu lösen.

Die hippokampal-präfrontale Konnektivität spielt eine entscheidende Rolle bei der Modulation der kognitiven Funktionen, und Dysfunktionen wurden mit verschiedenen neurologischen Störungen in Verbindung gebracht ^7,8. Dual-Elektroden-Aufzeichnungen dieser Regionen können Aufschluss über diese Wechselwirkungen geben. Leider gibt es nur begrenzte Informationen über Methoden zur Durchführung von Doppelelektroden-LFP-Aufnahmen zwischen diesen Bereichen. Darüber hinaus sind kommerziell erhältliche Aufzeichnungsgeräte in der Regel teuer und nicht an spezifische Versuchsdesigns anpassbar. Bei der herkömmlichen Methode zur Aufzeichnung von LFPs wird das Aufzeichnungsgerät mit einem abgeschirmten Kabel an Elektroden angeschlossen, die in das Gehirn eines Tieres implantiert werden. Dieser Ansatz ist jedoch anfällig für Bewegungsartefakte und Umgebungsgeräusche, die sich auf die Qualität und Zuverlässigkeit der aufgezeichneten Signale auswirken.

Dieses Protokoll beschreibt ein umfassendes Verfahren zur Durchführung von LFP-Aufzeichnungen mit zwei Elektroden im Hippocampus und im präfrontalen Kortex der Maus unter Verwendung eines kostengünstigen, speziell entwickelten Kopftisches, der auf dem Kopf des Tieres platziert werden kann. Diese Methoden ermöglichen es den Forschern, regionsspezifische oszillatorische Muster innerhalb zweier diskreter Hirnregionen zu untersuchen und den interregionalen Informationsaustausch und die Konnektivität zwischen diesen Bereichen zu untersuchen.

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Protokoll

Diese Studie wurde von der Florey Animal Ethics Commission (The University of Melbourne, Nr. 22-025UM) in Übereinstimmung mit dem australischen Kodex für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden C57BL/6 männliche Mäuse (8 Wochen) verwendet, die vom Animal Resources Centre (Australien) gewonnen wurden.

1. Design und Herstellung von Headstage

HINWEIS: Die Headstage-Leiterplatte ist eine kompakte 14 mm x 12 mm große vierlagige Platine, die direkt auf den Kopf des Tieres aufgesetzt werden kann. Es verwendet einen kommerziellen Verstärkerchip (siehe Materialtabelle), und alle Design- und Gerber-Dateien sind online verfügbar (GitHub-Link: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).

1. Geben Sie dem Hersteller die folgenden Spezifikationen an: Dicke der Platte: 0,6 mm; Minimaler Tracking/Abstand: 4 mils; Minimale Lochgröße: 0,2 mm.
2. Befolgen Sie während des Leiterplattenbestückungsprozesses diese Reihenfolge:
   1. Löten Sie den Verstärkerchip mit einer Heißluftpistole auf die Platine, die auf 350 °C eingestellt ist.
   2. Löten Sie die passiven Komponenten.
   3. Löten Sie den SPI-Stecker und den Elektrodenstecker (siehe Materialtabelle).
3. Prüfen Sie das Löten zur Qualitätssicherung unter dem Mikroskop. Befestigen Sie den SPI-Stecker mit Epoxidharz für zusätzliche Stabilität.
4. Verwenden Sie für die Signalerfassung Aufzeichnungssoftware von Drittanbietern und eine Steuerplatine (siehe Materialtabelle). Detaillierte Anweisungen finden Sie im Benutzerhandbuch der Software.
5. Die entworfene Kopfbühne unterstützt 8 Kanäle. Aktivieren Sie in der Software die Kanäle 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 und 23 für die Aufnahme.

2. Herstellung von Elektroden

1. Schneiden Sie PFA-beschichtete Wolframdrähte (siehe Materialtabelle) auf bestimmte Längen für verschiedene Elektrodentypen zu: präfrontale Kortexelektrode (12 mm), Hippocampus-Elektrode (10 mm) und Masseelektrode (6 mm).
2. Schneiden Sie das Messingrohr (siehe Werkstofftabelle) in 3 mm große Segmente.
3. Entfernen Sie 2 mm der Beschichtung am Ende jedes Drahtes mit einem Feuerzeug und löten Sie dann den Elektrodendraht sicher mit dem Messingrohr zusammen. Das Messingrohr hat einen Innendurchmesser von 0,45 mm und einen Außendurchmesser von 0,60 mm.
4. Für die Masseelektrode löten Sie eine Schraube aus Edelstahl M1.2 (siehe Werkstofftabelle) an die Elektrode. Tragen Sie Flussmittel auf Phosphorsäurebasis auf die Schraube auf, um das Löten zu verbessern. Reinigen Sie die Schraube nach dem Löten mit Alkohol.
   HINWEIS: Tragen Sie zum Schutz während des Lötvorgangs Handschuhe.

3. Chirurgischer Eingriff

1. Betäuben Sie die Maus in einer Anästhesiekammer mit 3% Isofluran und 1 L/min Sauerstofffluss.
2. Legen Sie die betäubte Maus auf ein Heizkissen und befestigen Sie sie in einem stereotaktischen Rahmen (siehe Materialtabelle).
3. Passen Sie die Erhaltungsrate von Isofluran auf 2,5-3% an und reduzieren Sie den Sauerstofffluss auf 500 mL/min. Überprüfen Sie anhand der Zehenklemme, ob das Tier noch unter tiefer Narkose steht.
4. Injizieren Sie subkutan Carprofen in einer Menge von 0,5 mg/kg und tragen Sie Augensalbe zum Augenschutz auf.
5. Rasieren und sterilisieren Sie den Kopf der Maus mit Povidon-Jod und 80% Ethanol.
6. Machen Sie einen 8-mm-Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut und entfernen Sie das Bindegewebe im Schnittbereich.
7. Tragen Sie Wasserstoffperoxid auf, um die Oberfläche des Schädels zu reinigen, und achten Sie darauf, die umgebende Haut nicht zu berühren.
8. Richten Sie die Bregma- und Lambda-Orientierungspunkte auf die gleiche Höhe aus, um eine genaue Elektrodenplatzierung zu gewährleisten (Bregma und Lambda sind dort, wo die sagittale Naht die koronale und die lambdoide Naht schneidet).
9. Bohren Sie Löcher für Referenz-/Masseelektrode, Ankerschrauben (0,9 mm Bohrgrat) und aktive Elektroden (0,3 mm Bohrgrat) an vorgegebenen Koordinaten.
10. Befestigen Sie die maßgefertigte Elektrode (Schritt 2) am stereotaktischen Rahmenarm und stellen Sie sicher, dass sie senkrecht zum Gehirn steht.
11. Implantieren Sie die Elektrode in den hippokampalen CA1-Bereich (AP - 1,8 mm, ML - 1,3 mm, DV - 1,4 mm).
    HINWEIS: AP, anteroposterior; ML, mediolateral; DV, dorsoventral.
12. Wiederholen Sie die Elektrodenimplantation in den präfrontalen Kortex (AP - 2,0 mm, ML - 0,3 mm, DV - 1,7 mm).
13. Sichern Sie die Elektroden mit einem handelsüblichen leistungsstarken Klebstoff und Zahnzement (siehe Materialtabelle).
14. Implantieren Sie zwei 1,2 mm Ankerschrauben (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm), um Bewegungen zu verhindern.
15. Positionieren Sie die Referenz-/Masseelektrode in direktem Kontakt mit der Dura mater, 2 mm posterior und 2 mm einseitig zum Lambda-Landmarke.
16. Verbinden Sie die Messingrohrseite der Elektroden mit einem mehrkanaligen Buchsenstecker (siehe Materialtabelle) mit der Masseelektrode in der Mitte.
17. Verwenden Sie zur Isolierung einen 0,8-mm-Schrumpfschlauch an der Außenseite des mittleren Stifts.
18. Befestigen Sie die Elektroden, Ankerschrauben und den Verbinder mit Klebstoff und Zahnzement.

4. Nachsorge

1. Um postoperative Schmerzen zu lindern, injizieren Sie Carprofen in einer Dosis von 5-10 mg/kg subkutan alle 12-24 Stunden, basierend auf einer Beurteilung der Schmerzen über einen Zeitraum von drei Tagen.
2. Geben Sie dem Tier eine einwöchige Erholungsphase, bevor Sie mit Aufzeichnungs- oder Versuchsverfahren beginnen.

5. Ablauf der Aufzeichnung

1. Fassen Sie das Tier an drei aufeinanderfolgenden Tagen zweimal täglich 15 Minuten lang an.
2. Heben Sie die Mäuse auf, indem Sie die Hand vorsichtig um sie schließen, ohne übermäßigen Druck auszuüben.
3. Legen Sie das Kopfbrett an drei aufeinanderfolgenden Tagen einmal täglich für 30 Minuten auf den Kopf des Tieres.
4. Gewöhnen Sie das Tier am Aufnahmetag für 30 Minuten an den Aufnahmeraum.
5. Setzen Sie das Tier in eine kleine Aufzeichnungskammer in einem Faradayschen Käfig, um externe elektrische Störungen zu reduzieren. Schließen Sie die benutzerdefinierte Headstage für die Aufnahme an.
6. Öffnen Sie die Aufnahmesoftware und wählen Sie eine Abtastrate von 2,00 kHz. Deaktivieren Sie alle Kanäle außer 13 und 20, indem Sie jeden Kanal auswählen und die Leertaste drücken.
7. Legen Sie im Fenster Hardwarebandbreite die untere Bandbreite auf 2 Hz und die obere Bandbreite auf 100 Hz fest.
8. Stellen Sie im Software-Filterfenster den Tiefpassfilter auf 100 Hz und den Hochpassfilter auf 2 Hz ein.
9. Wählen Sie den Speicherpfad aus, indem Sie auf Dateiname auswählen klicken und dann auf Aufzeichnen klicken.
10. Beginnen Sie jede Aufzeichnungssitzung mit einer 10-minütigen Gewöhnungsphase, gefolgt von einer 15-minütigen EEG-Aufzeichnung zu Studienbeginn.
11. Verabreichen Sie das Medikament nach der Baseline-Aufzeichnung durch intraperitoneale Injektion und setzen Sie die Aufzeichnung ohne Verzögerung für weitere 30 Minuten fort.
    HINWEIS: Im Abschnitt Ergebnisse finden Sie Einzelheiten zu den verwendeten Arzneimitteln.

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Ergebnisse

Die hier gezeigten Ergebnisse zeigen die Auswirkungen verschiedener Wirkstoffe auf die Eigenschaften lokaler Feldpotentiale (LFPs), die an vier Kohorten von männlichen C57BL/6-Mäusen getestet wurden (n = 8 für jede Kohorte; Alter: 8 Wochen; Gewicht: 24,0 ± 0,42 g). Zu den getesteten Medikamenten gehörten das Antipsychotikum Clozapin, die Kaliumkanalmodulatoren 4-Aminopyridin (4-AP) und Retigabin sowie die Kochsalzlösung des Kontrollvehikels.

Wie in Abbildung 1

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Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt das Verfahren zur Konstruktion eines maßgeschneiderten Kopftisches, der speziell für die gleichzeitige Aufzeichnung von dualen lokalen Feldpotentialen (LFPs) im Hippocampus (HIP) und im präfrontalen Kortex (PFC) entwickelt wurde. Die detaillierten Schritte in diesem Protokoll bieten den Forschern ausreichende Informationen, um die Signalkommunikation sowohl innerhalb jeder Region als auch zwischen HIP und PFC gründlich zu untersuchen.

Der speziell...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass tube	Albion Alloys, USA	Inside diameter of 0.45 mm
Carprofen	Rimadyl, Pfizer Animal Health
Commercial amplifier chip	Intantech	RHD 2132
Control board	Intantech	RHD recording system
Dental cement	Paladur
Heat shrinks	Panduit	0.8 mm diameter
M1.2 stainless steel screw	Watch tools	Clock and watch screw
Multichannel socket connector	Harwin, AU	1.27 mm pitch, PCB socket
PFA-coated tungsten wires	A-M SYSTEMS, USA	Inside diameter of 150 µm
Phosphoric acid-based flux	Chip Quik	CQ4LF-0.5
Recording software	Intantech	RHX recording software
Stereotactic Frame	World Precision Instruments	Mouse stereotactic instrument
Super glue	UHU	Ultra fast