Demonstration einer selbstorganisierten Zellblattkultur und manuelle Generierung eines 3D-Sehnen-/Ligamenten-ähnlichen Organoids unter Verwendung humaner dermaler Fibroblasten

Zusammenfassung

Darin demonstrieren wir ein dreistufiges Organoidmodell (zweidimensionale [2D]-Expansion, 2D-Stimulation, dreidimensionale [3D]-Reifung), das ein vielversprechendes Werkzeug für die Sehnengrundlagenforschung und eine potenziell gerüstfreie Methode für das Tendon Tissue Engineering bietet.

Zusammenfassung

Sehnen und Bänder (T/L) sind starke, hierarchisch organisierte Strukturen, die den Bewegungsapparat vereinen. Diese Gewebe haben eine streng angeordnete Kollagen-Typ-I-reiche extrazelluläre Matrix (EZM) und Zellen der T/L-Linie, die hauptsächlich in parallelen Reihen angeordnet sind. Nach einer Verletzung benötigen T/L eine lange Zeit für die Rehabilitation mit hohem Ausfallrisiko und oft unbefriedigenden Reparaturergebnissen. Trotz der jüngsten Fortschritte in der T/L-Biologieforschung besteht eine der verbleibenden Herausforderungen darin, dass es im T/L-Bereich immer noch kein standardisiertes Differenzierungsprotokoll gibt, das in der Lage ist, den T/L-Bildungsprozess in vitro zu rekapitulieren. Zum Beispiel erfordert die Knochen- und Fettdifferenzierung von mesenchymalen Vorläuferzellen nur eine standardmäßige zweidimensionale (2D) Zellkultur und die Zugabe spezifischer Stimulationsmedien. Zur Differenzierung zum Knorpel ist eine dreidimensionale (3D) Pelletkultur und eine Supplementierung von TGFß notwendig. Für die Zelldifferenzierung zur Sehne ist jedoch ein sehr geordnetes 3D-Kulturmodell erforderlich, das idealerweise auch einer dynamischen mechanischen Stimulation unterzogen werden kann. Wir haben ein 3-stufiges Organoidmodell (Expansion, Stimulation und Reifung) etabliert, um eine 3D-stäbchenartige Struktur aus einem selbstorganisierten Zellblatt zu bilden, das eine natürliche Mikroumgebung mit eigenen EZM-, autokrinen und parakrinen Faktoren liefert. Diese stäbchenartigen Organoide haben eine mehrschichtige zelluläre Architektur innerhalb einer reichhaltigen EZM und können recht einfach gehandhabt werden, um statischer mechanischer Belastung ausgesetzt zu werden. Hier haben wir das 3-Stufen-Protokoll anhand von kommerziell erhältlichen dermalen Fibroblasten demonstriert. Wir konnten zeigen, dass dieser Zelltyp robuste und EZM-reiche Organoide bildet. Das beschriebene Verfahren kann hinsichtlich der Nährmedien weiter optimiert und in Richtung dynamischer axial-mechanischer Stimulation optimiert werden. Auf die gleiche Weise können alternative Zellquellen auf ihr Potenzial getestet werden, T/L-Organoide zu bilden und so eine T/L-Differenzierung zu durchlaufen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der etablierte 3D-T/L-Organoid-Ansatz als Modell für die Sehnengrundlagenforschung und sogar für das gerüstfreie T/L-Engineering verwendet werden kann.

Einleitung

Sehnen und Bänder (T/L) sind wichtige Bestandteile des Bewegungsapparates, die dem Körper wesentliche Unterstützung und Stabilität bieten. Trotz ihrer entscheidenden Rolle ist dieses Bindegewebe anfällig für Degeneration und Verletzungen, was zu Schmerzen und Einschränkungen der Beweglichkeit führt¹. Darüber hinaus können ihre eingeschränkte Blutversorgung und ihre langsame Heilungsfähigkeit zu chronischen Verletzungen führen, während Faktoren wie Alterung, wiederholte Bewegungen und unsachgemäße Rehabilitation das Risiko von Degeneration und Verletzungen weiter erhöhen². Konventionelle Behandlungen wie Ruhe, Physiotherapie und chirurgische Eingriffe sind nicht in der Lage, die T/L-Struktur und -Funktion vollständig wiederherzustellen. In den letzten Jahren haben sich Forscher bemüht, die komplizierte Natur von T/L besser zu verstehen, um wirksame Behandlungen für T/L-Störungen zu finden ^3,4,5. T/L zeichnen sich durch eine hierarchisch organisierte, extrazelluläre Matrix (ECM)-dominierte Struktur aus, die hauptsächlich aus Typ-I-Kollagenfasern und Proteoglykanen besteht, ein Merkmal, das in vitro nur schwer repliziert werden ^{kann 6}. Herkömmliche zweidimensionale (2D) Zellkulturmodelle erfassen nicht die charakteristische dreidimensionale (3D) Organisation von T/L-Geweben, was ihr translationales Potenzial einschränkt und den innovativen Fortschritt auf dem Gebiet der T/L-Regeneration behindert.

In jüngster Zeit bietet die Entwicklung von 3D-Organoidmodellen neue Möglichkeiten, die Grundlagenforschung und das gerüstfreie Tissue Engineering verschiedener Gewebetypen voranzutreiben 7,8,9,10,11,12,13. Um beispielsweise den myotendinösen Übergang zu untersuchen, entwickelten Larkin et al. 2006 3D-Skelettmuskelkonstrukte zusammen mit selbstorganisierten Sehnensegmenten, die von der Rattenschwanzsehne^{abgeleitet wurden 10}. Darüber hinaus steuerten Schiele et al. 2013 durch die Verwendung von mikromaschinell bearbeiteten, mit Fibronektin beschichteten Wachstumskanälen die Selbstorganisation menschlicher dermaler Fibroblasten zur Bildung von Zellfasern ohne die Hilfe eines 3D-Gerüsts, ein Ansatz, der Schlüsselmerkmale der embryonalen Sehnenentwicklung erfassen kann¹¹. In der Studie von Florida et al. 2016 wurden Knochenmark-Stromazellen zunächst in Knochen- und Bänderlinien expandiert, um dann selbstorganisierte Monolayer-Zellschichten zu erzeugen, die dann implementiert wurden, um ein mehrphasiges Knochen-Band-Knochen-Konstrukt zu schaffen, das das native vordere Kreuzband nachahmt, ein Modell, das auf ein verbessertes Verständnis der Bandregeneration abzielt¹². Um die Mechanotransduktionsprozesse von Sehnen aufzuklären, verwendeten Mubyana et al. 2018 eine gerüstfreie Methodik, bei der einzelne Sehnenfasern erzeugt und einem mechanischen Belastungsprotokoll^{unterzogen wurden 13}. Organoide sind selbstorganisierte 3D-Strukturen, die die native Architektur, Mikroumgebung und Funktionalität von Geweben nachahmen. 3D-Organoidkulturen bieten ein physiologisch relevanteres Modell für die Untersuchung der Gewebe- und Organbiologie sowie der Pathophysiologie. Solche Modelle können auch verwendet werden, um die gewebespezifische Differenzierung verschiedener Stamm-/Vorläuferzelltypen zu induzieren ^14,15. Daher wird die Implementierung von 3D-Organoidmodellen im Bereich der T/L-Biologie und des Tissue Engineering zu einem sehr attraktiven Ansatz ^9,16. Alternative Zellquellen können für den Organoid-Assemblierung implementiert und zur tenogenen Differenzierung angeregt werden. Ein relevanter Zelltyp, der in dieser Studie zur Demonstration verwendet wurde, sind die dermalen Fibroblasten ^7,17,18. Diese Zellen sind durch ein Hautbiopsieverfahren leicht zugänglich, das im Vergleich zur Knochenmarkpunktion oder Fettabsaugung weniger invasiv ist und aufgrund ihrer guten Proliferationsfähigkeit relativ schnell in großer Zahl vermehrt werden kann. Im Gegensatz dazu ist es schwieriger, spezialisiertere Zelltypen, wie z. B. T/L-residente Fibroblasten, zu isolieren und zu vermehren. Daher wurden dermale Fibroblasten auch als Ausgangspunkt für Zellreprogrammierungstechnologien hin zu induzierten pluripotenten embryonalen Stammzellen verwendet¹⁹. Wenn dermale Fibroblasten spezifischen 3D-Kulturbedingungen und Signalsignalen ausgesetzt werden, wie z. B. dem transformierenden Wachstumsfaktor-beta 3 (TGFß3), von dem berichtet wurde, dass er als Schlüsselregulator verschiedener zellulärer Prozesse, einschließlich der Bildung und Aufrechterhaltung von T/L, wirkt, kann dies ihre in vitro tenogene Differenzierung potenzieren, die zur Expression sehnenspezifischer Gene und zur Ablagerung von T/L-typischer EZM^{führt 20, 21}. Urheberrecht

In dieser Arbeit beschreiben und demonstrieren wir ein bereits etabliertes und implementiertes 3-stufiges (2D-Expansion, 2D-Stimulation und 3D-Reifung) Organoid-Protokoll, das kommerziell erhältliche normale adulte humane dermale Fibroblasten (NHDFs) als Zellquelle verwendet und ein wertvolles Modell für die Untersuchung der In-vitro-Tenogenese darstellt⁷. Trotz der Tatsache, dass dieses Modell nicht äquivalent zu In-vivo-T /L-Gewebe ist, bietet es dennoch ein physiologisch relevanteres System, das zur Untersuchung zellulärer Differenzierungsmechanismen, zur Nachahmung der T/L-Pathophysiologie in vitro und zur Etablierung von T/L-personalisierten Medizin- und Wirkstoffscreening-Plattformen verwendet werden kann. Darüber hinaus können in zukünftigen Studien evaluiert werden, ob die 3D-Organoide durch weitere Optimierung für ein gerüstfreies T/L-Engineering geeignet sind und für die Entwicklung von mechanisch robusten Konstrukten nutzbar sind, die den Abmessungen und strukturellen und biophysikalischen Eigenschaften von nativen T/L-Geweben sehr ähnlich sind.

Protokoll

HINWEIS: Alle Schritte müssen mit aseptischen Techniken durchgeführt werden.

1. Kultur und Vorausbau von NHDFs

1. Tauen Sie das Kryofläschchen mit adulten kryokonservierten normalen dermalen Fibroblasten (NHDFs, 1 x 10⁶ Zellen) schnell bei 37 °C auf, bis sie fast aufgetaut sind.
2. Geben Sie langsam 1 ml vorgewärmtes Fibroblasten-Wachstumsmedium 2 (gebrauchsfertiges Kit mit Basalmedium, 2 % fötalem Kälberserum (FCS), basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und Insulin), ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Streptokokken) (NHDF-Medium), vorgewärmt bei 37 °C, zu den Zellen.
3. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
4. Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 12 mL vorgewärmtem NHDF-Medium.
5. Die Zellen werden in einen T-75-Kolben umgefüllt und kurz über Kreuz geschüttelt. Stellen Sie den T-75-Kolben bei 37 °C in einen 5 % CO₂ -befeuchteten Inkubator.
6. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage. Beobachten Sie die NHDFs unter einem Mikroskop, bis sie eine Konfluenz von 70 % - 80 % erreichen.

2. 2D-Erweiterung

1. Nehmen Sie den T-75-Kolben aus dem Inkubator und entfernen Sie das NHDF-Medium. Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmter Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS).
2. Geben Sie 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA in die Zellen. Die Zellen werden bei 37 °C in einem mit 5 % CO₂ befeuchteten Inkubator inkubiert, bis sich die Zellen aus dem Kolben lösen (ca. 3 Minuten).
3. Fügen Sie 6 ml vorgewärmtes NHDF-Medium hinzu, um die Trypsinwirkung zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen.
4. Die Zellen werden bei 300 x g für 5 min bei RT zentrifugiert und der Überstand entfernt.
5. Resuspendieren Sie das Zellpellet in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) niedriger Glukose, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1x MEM-Aminosäuren, 1 % Pen/Streptokokken, vorgewärmt auf 37 °C.
6. Die NHDFs werden in einer 10 cm großen adhärenten Zellkulturschale mit einer Dichte von 8 x 10³ NHDFs/cm² (insgesamt 4,4 x 10⁵ NHDFs pro 10 cm Schale) plattiert. Schaukeln Sie sanft über Kreuz.
7. Stellen Sie die 10 cm große Zellkulturschale bei 37 °C in einen 5 % CO₂ -befeuchteten Inkubator. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage
8. Überwachen Sie die Zellen unter dem Mikroskop bis zum Erreichen einer Konfluenz von 100% (ca. 5 Tage).

3. 2D-Stimulation

1. Nehmen Sie die 10 cm großen Zellkulturschalen mit den NHDFs (aus den Schritten 2.6 und 2.7) aus dem Inkubator. Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem PBS.
2. 10 ml DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS, 50 μg/ml Ascorbinsäure und 1 % Pen/Streptokokken, vorgewärmt auf 37 °C, hinzufügen.
3. Stellen Sie die Petrischale bei 37 °C in eine mit 5 % CO₂ befeuchtete Atmosphäre. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
4. Überwachen Sie die NHDFs 14 Tage lang unter einem Mikroskop.

4. 3D Reifung

1. Nehmen Sie die 10-cm-Zellkulturschale aus dem Inkubator und entfernen Sie das DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt.
2. Lösen Sie das gebildete Zellblatt vorsichtig und schnell mit einem Zellschaber von der Schale. Während des Ablösens rollen Sie gleichzeitig das Zellblatt zu einem 3D-stäbchenartigen Organoid.
3. Nehmen Sie die NHDF-Organoide auf und legen Sie sie in eine 10 cm große, nicht adhärente (für Zellen) Petrischale. Dieser Schalentyp wird verwendet, um eine Abwanderung von Zellen aus dem Organoid in den Kunststoff zu verhindern.
4. Sammeln Sie zu diesem Zeitpunkt oder einen Tag danach (Tag 0 oder Tag 1 der 3D-Reifung) einige der Organoide für weitere Analysen wie Nassgewicht, histologische Bewertung (Organoide am Tag 1 sind vorzuziehen, da sie kompakter werden), RNA- und Proteinisolierung.
5. Fixieren Sie die Ränder des Organoids mit Metallstiften wie folgt:
   1. Halten Sie eine Seite des Organoids vorsichtig mit einer Pinzette fest und wenden Sie mit einer anderen Pinzette vorsichtig eine manuelle Dehnung von ca. 10 % axialer Dehnung an. Um die axiale Dehnung von 10 % zu schätzen, verwenden Sie ein Millimeterpapier oder Lineal.
   2. Nehmen Sie als Nächstes eine Metallnadel mit der Pinzette auf und drücken Sie sie manuell durch den Organoidrand in die Plastikschale, um sie zu fixieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem zweiten Stift an der zweiten Kante des Organoids.
6. 10 ml DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS, 1x MEM-Aminosäuren, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 10 ng/ml TGFß3 und 1 % Pen/Streptokokken, auf 37 °C vorgewärmt, hinzufügen.
7. Stellen Sie die 10-cm-Schüssel bei 37 °C in einer mit 5 % CO₂ befeuchteten Atmosphäre auf. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
8. Überwachen Sie die Organoide regelmäßig für 14 Tage.
   HINWEIS: Stifte können sich lösen, daher mit der gleichen Technik wie in Schritt 4.5 beschrieben wieder fixieren.
9. Entfernen Sie nach 14 Tagen das DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt aus den Organoiden. Die Organoide mit vorgewärmtem PBS waschen.
10. Messen Sie Organoide für das Nassgewicht an Tag 0 und Tag 14 mit einer Präzisionswaage.
    1. Stellen Sie eine leere 10-cm-Schale auf die Waage und tarieren Sie das Gewicht auf Null, um sicherzustellen, dass nur das Gewicht der Organoide gemessen wird. Nehmen Sie das Nährmedium vollständig aus der 10-cm-Schale und messen Sie das Organoid-Nassgewicht nacheinander.
       HINWEIS: In dieser Studie wurden an Tag 0 drei Organoide pro Spender und an Tag 14 zwei Organoide pro Spender gewogen.
11. Entsprechend den Studienzwecken wird ein Teil der NHDF-Organoide in weitere histologische Analysen implementiert oder mit sterilen DNA/RNA-freien Röhrchen für die anschließende DNA-, RNA- und Proteinisolierung sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend bei -80 °C gelagert.
12. Für die histologische Untersuchung wird jedes Organoid 45 Minuten lang in 5 ml vorgekühltem (4 °C) 4 % Paraformaldehyd in PBS (auf neutralen pH-Wert eingestellt) auf Eis fixiert, gefolgt von PBS-Waschen bei RT (jeweils 2 x 5 Minuten).
13. Kryoschützen Sie die fixierten Organoide mit einem Saccharosegradienten, indem Sie die Organoide für die Histologie in Gläser legen. Inkubieren Sie die Organoide in 10 % Saccharose in PBS-Lösung für 2 Stunden bei 4 °C, danach 20 % Saccharose/PBS für 2 Stunden bei 4 °C und schließlich 30 % Saccharose/PBS über Nacht bei 4 °C. Wechseln Sie die Saccharoselösungen, indem Sie sie zuerst auspipettieren und dann mit der neuen Lösung auffüllen.
14. Betten Sie die Organoide in Kryomedium ein.
    1. Eine Kupferplatte auf das Trockeneis in einer Styroporbox legen und 10 Min. abkühlen lassen.
    2. Legen Sie anschließend eine mit Kryomedium vorgefüllte Kryoform aus Kunststoff auf die Kupferplatte und drücken Sie das Organoid mit einer Pinzette vorsichtig auf den Boden der Kryoform. Warten Sie, bis das Kryomedium vollständig gefroren ist.
    3. Bei langen Organoiden schneidest du zuerst mit einem Skalpell in zwei Hälften und legst die beiden Hälften parallel zueinander in die Kryoform. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Organoid, das einer histologischen Analyse unterzogen werden soll.
15. Lagern Sie die Proben bei -20 °C bis zur Kryosektion.
16. Schneiden Sie die Organoide mit einem Kryotom in 10 μm dicken Abschnitten in Längsrichtung und unterziehen Sie sie einer histologischen Färbung wie Hämatoxylin und Eosin (H&E) unter Verwendung des Standardprotokolls⁸.

Ergebnisse

Das 3D-T/L-Organoidmodell wurde zuvor etabliert und hier durch die Implementierung von kommerziell erworbenem NHDF demonstriert (n=3, 3 Organoide pro Spender, NHDF wurden in den Passagen 5-8 verwendet). Der Modell-Workflow ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Abbildung 2 zeigt repräsentative Phasenkontrastbilder der NHDF-Kultur während der Vorexpansion in T-75-Kolben (Abbildung 2A) sowie zu Beginn und nach 5 Tagen Kultur im 2D-Expa...

Diskussion

Die in dieser Studie gezeigten Ergebnisse liefern wertvolle Einblicke in die Etablierung und Charakterisierung des NHDF 3D-Organoidmodells zur Untersuchung von T/L-Geweben. Das 3-Stufen-Protokoll führte zur Bildung von 3D-stäbchenförmigen Organoiden, die typische Merkmale der T/L-Nische aufweisen. Dieses Modell wurde bereits in Kroner-Weigl et al. 2023⁷ berichtet und hier sehr detailliert demonstriert.

Die Phasenkontrastbilder in Abbildu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	A8960
10 cm adherent cell culture dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430167
10 cm non-adherent petri dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430591
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4583
Cryomold standard	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany	A2211
DMEM high glucose medium	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
Fetal bovine serum	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-23020
H&E staining kit	Abcam	ab245880
Inverted microscope with high resolution camera	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
Metal pins	EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic	04.31
Normal human dermal fibroblasts	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-12302
Paraformaldehyde	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
Penicillin/streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15140122
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, Wiesbaden, Germany	8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	TRY-1B