Herstellung und Charakterisierung von kolorektalen Krebs-Organoiden aus der SW1222-Zelllinie in ultrakurzer selbstorganisierender Peptidmatrix

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, biofunktionelle selbstorganisierende Peptide auf Zelladhäsion, Organoidmorphologie und Genexpression durch Immunfärbung zu bewerten. Wir werden eine Darmkrebszelllinie verwenden, um eine kostengünstige Möglichkeit zu bieten, Organoide für intensive Tests zu gewinnen.

Zusammenfassung

Ultrakurze selbstorganisierende Peptide (SAPs) können spontan Nanofasern bilden, die der extrazellulären Matrix ähneln. Diese Fasern ermöglichen die Bildung von Hydrogelen, die biokompatibel, biologisch abbaubar und nicht immunogen sind. Wir haben bereits bewiesen, dass SAPs, wenn sie mit proteinabgeleiteten Motiven biofunktionalisiert werden, die extrazellulären Matrixeigenschaften nachahmen können, die die Bildung kolorektaler Organoide unterstützen. Diese biofunktionellen Peptid-Hydrogele behalten die mechanischen Eigenschaften, die Abstimmbarkeit und die Druckbarkeit des ursprünglichen Ausgangspeptids bei und enthalten gleichzeitig Hinweise, die Zell-Matrix-Wechselwirkungen ermöglichen, um die Zelladhäsion zu erhöhen. In diesem Artikel werden die Protokolle vorgestellt, die erforderlich sind, um die Auswirkungen verschiedener biofunktioneller Peptidhydrogele auf die Zelladhäsion und Lumenbildung unter Verwendung einer Adenokarzinom-Krebszelllinie zu bewerten und zu charakterisieren, die in der Lage ist, kolorektale Krebsorganoide kostengünstig zu bilden. Diese Protokolle werden dazu beitragen, die Auswirkungen von biofunktionellen Peptid-Hydrogelen auf die Zelladhäsion und die Luminalbildung mithilfe von Immunfärbung und Fluoreszenzbildanalyse zu bewerten. Die in dieser Studie verwendete Zelllinie wurde zuvor zur Erzeugung von Organoiden in tierischen Matrizen verwendet.

Einleitung

In den letzten Jahren haben sich selbstorganisierende Peptide (SAPs) als vielversprechende Biomaterialien für Tissue-Engineering-Anwendungen herauskristallisiert. SAPs besitzen einzigartige Eigenschaften, darunter die spontane Bildung von Nanofasern, Biokompatibilität, biologische Abbaubarkeit und Nicht-Immunogenität, was sie zu attraktiven Kandidaten für die Gerüstentwicklung^{macht 1}. SAPs wurden zuvor zusammen mit verschiedenen Zelltypen verwendet, und insbesondere berichtete ultrakurze SAPs haben die Verkapselung von Stammzellen erleichtert und gleichzeitig ihre Pluripotenz über längere Zeiträume von mehr als 30 Passagen....

Protokoll

1. Vorbereitung des Puffers und der Lösung

HINWEIS: Bei allen angegebenen Konzentrationen handelt es sich um Endkonzentrationen.

1. Fügen Sie fötales Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin in einer Endkonzentration von 10 % bzw. 1 % hinzu, um vollständiges Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) herzustellen. Im Dunkeln bei 4 °C bis zu 1 Monat lagern.
2. Mischen Sie MgCl₂ (3 mM), Saccharose (300 mM) und Triton X-100 (0,5%) in Phosphatpuffersalzlösung (PBS), um den Permeabilisierungspuffer herzustellen. Lagern Sie diese Lösung bis zu 2 Monate bei 4 °C.
3. Kombinieren Sie Rinderseruma....

Diskussion

Das enorme Potenzial von SAPs in der biomedizinischen Forschung wird durch ihre Formbarkeit und Anpassungsfähigkeit durch Biofunktionalisierung unterstrichen. Bei einer so umfangreichen Palette von Permutationen ergibt sich die Herausforderung, die vielversprechendsten Konfigurationen für spezifische Anwendungen, insbesondere in der Organoidforschung, effizient zu testen und zu bestimmen. Eine schnelle und kostengünstige Lösung ist von größter Bedeutung. Die SW1222-Zelllinie, die aus dem humanen kolorektalen Adenok.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	14190144
6-well plate, tissue culture treated	Corning	07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesium	Gibco	70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906
24-well plate, tissue culture treated	Corning	09-761-146
96-well black plate, tissue culture treated	Corning	07-200-565
alamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab40839	Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal	Abcam	ab16505	Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal	Abcam	ab190085	Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Cellpose 2.0	NA	NA	Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan	ZEISS	LSM 880
DAPI	Invitrogen	D1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055
Glycine	Cytiva	GE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633	Invitrogen	35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)	Gibco	16140071
ImageJ 1.54f	NIH	NA
IMDM	Gibco	12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Invitrogen	L3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)	Sigma-Aldrich	M2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free	Corning	356255	Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOS	Thermo Scientific	EVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154	OriginLab Corp	NA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
Round Cover Slip, 10 mm diameter	VWR	631-0170
Scanning Electron Microscope	Thermo Fisher - FEI	TENEO VS
Sterile 30 μm strainer	Sysmex	04-004-2326
sucrose	Sigma-Aldrich	S1888
SW1222 cell line	ECACC	12022910
Triton x-100	Thermo Scientific	85111
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
UltraPure water	Invitrogen	10977015