Multiplex-Lebendzell-Bildgebung für das Ansprechen auf Medikamente in patientenabgeleiteten Organoidmodellen von Krebs

Zusammenfassung

Patient-Derived Tumor Organoids sind ein ausgeklügeltes Modellsystem für die Grundlagen- und translationale Forschung. Dieser Methodenartikel beschreibt die Verwendung von Multiplex-Fluoreszenz-Lebendzell-Imaging zur gleichzeitigen kinetischen Beurteilung verschiedener Organoid-Phänotypen.

Zusammenfassung

Patient-Derived Organoid (PDO) Modelle von Krebs sind ein multifunktionales Forschungssystem, das menschliche Krankheiten im Vergleich zu Krebszelllinien besser rekapituliert. PDO-Modelle können erzeugt werden, indem Tumorzellen von Patienten in extrazellulären Basalmembranextrakten (BME) kultiviert und als dreidimensionale Kuppeln plattiert werden. Kommerziell erhältliche Reagenzien, die für phänotypische Assays in Monolayer-Kulturen optimiert wurden, sind jedoch oft nicht mit BME kompatibel. Hier beschreiben wir eine Methode zur Platte von PDO-Modellen und zur Bewertung von Arzneimittelwirkungen mit einem automatisierten Lebendzell-Bildgebungssystem. Darüber hinaus verwenden wir Fluoreszenzfarbstoffe, die mit kinetischen Messungen kompatibel sind, um die Zellgesundheit und Apoptose gleichzeitig zu quantifizieren. Die Bilderfassung kann so angepasst werden, dass sie in regelmäßigen Zeitabständen über mehrere Tage erfolgt. Benutzer können Arzneimittelwirkungen in einzelnen Z-Ebenenbildern oder einer Z-Projektion von Serienbildern aus mehreren Brennebenen analysieren. Mit Hilfe der Maskierung werden bestimmte Parameter von Interesse berechnet, wie z. B. PDO-Zahl, Fläche und Fluoreszenzintensität. Wir liefern Proof-of-Concept-Daten, die die Wirkung von Zytostatika auf die Zellgesundheit, Apoptose und Lebensfähigkeit demonstrieren. Diese automatisierte kinetische Bildgebungsplattform kann auf andere phänotypische Messwerte erweitert werden, um verschiedene therapeutische Effekte in PDO-Modellen von Krebs zu verstehen.

Einleitung

Von Patienten stammende Tumororganoide (PDOs) entwickeln sich schnell zu einem robusten Modellsystem zur Untersuchung der Krebsentwicklung und des therapeutischen Ansprechens. PDOs sind dreidimensionale (3D) Zellkultursysteme, die das komplexe genomische Profil und die Architektur des Primärtumors rekapitulieren ^1,2. Im Gegensatz zu herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Kulturen immortalisierter Krebszelllinien erfassen und erhalten PDOs die intratumorale Heterogenität ^3,4, was sie zu einem wertvollen Werkzeug sowohl für die mechanistische als auch für ....

Protokoll

Studien mit menschlichen Tumorproben wurden vom University of Iowa Institutional Review Board (IRB), Protokoll #201809807, überprüft und genehmigt und in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, wie sie in der Helsinki-Erklärung von 1964 und ihren späteren Änderungen festgelegt sind. Die Einverständniserklärung wurde von allen an der Studie teilnehmenden Probanden eingeholt. Einschlusskriterien sind unter anderem die Diagnose Krebs und die Verfügbarkeit von Tumorproben.

1. Plattieren intakter PDOs in einer 96-Well-Platte

1. Reagenzien vorbereiten.
   1. 96-Well-Platten über Nacht auf 37 °C vorheizen....

Diskussion

PDO-Kulturen werden aufgrund ihrer Fähigkeit, zelluläre Reaktionen und Verhaltensweisen widerzuspiegeln, zu einem immer beliebteren In-vitro-Modellsystem². Bedeutende Fortschritte wurden bei der Erzeugung, Kultur und Expansion von PDO-Techniken erzielt, aber Methoden zur Analyse therapeutischer Reaktionen hinken hinterher. Kommerziell erhältliche 3D-Viabilitätskits sind lytische Endpunkt-Assays, bei denen potenziell wertvolle Daten zur kinetischen Reaktion fehlen und nachfolgende Analysen durc.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)