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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Patient-Derived Tumor Organoids sind ein ausgeklügeltes Modellsystem für die Grundlagen- und translationale Forschung. Dieser Methodenartikel beschreibt die Verwendung von Multiplex-Fluoreszenz-Lebendzell-Imaging zur gleichzeitigen kinetischen Beurteilung verschiedener Organoid-Phänotypen.

Zusammenfassung

Patient-Derived Organoid (PDO) Modelle von Krebs sind ein multifunktionales Forschungssystem, das menschliche Krankheiten im Vergleich zu Krebszelllinien besser rekapituliert. PDO-Modelle können erzeugt werden, indem Tumorzellen von Patienten in extrazellulären Basalmembranextrakten (BME) kultiviert und als dreidimensionale Kuppeln plattiert werden. Kommerziell erhältliche Reagenzien, die für phänotypische Assays in Monolayer-Kulturen optimiert wurden, sind jedoch oft nicht mit BME kompatibel. Hier beschreiben wir eine Methode zur Platte von PDO-Modellen und zur Bewertung von Arzneimittelwirkungen mit einem automatisierten Lebendzell-Bildgebungssystem. Darüber hinaus verwenden wir Fluoreszenzfarbstoffe, die mit kinetischen Messungen kompatibel sind, um die Zellgesundheit und Apoptose gleichzeitig zu quantifizieren. Die Bilderfassung kann so angepasst werden, dass sie in regelmäßigen Zeitabständen über mehrere Tage erfolgt. Benutzer können Arzneimittelwirkungen in einzelnen Z-Ebenenbildern oder einer Z-Projektion von Serienbildern aus mehreren Brennebenen analysieren. Mit Hilfe der Maskierung werden bestimmte Parameter von Interesse berechnet, wie z. B. PDO-Zahl, Fläche und Fluoreszenzintensität. Wir liefern Proof-of-Concept-Daten, die die Wirkung von Zytostatika auf die Zellgesundheit, Apoptose und Lebensfähigkeit demonstrieren. Diese automatisierte kinetische Bildgebungsplattform kann auf andere phänotypische Messwerte erweitert werden, um verschiedene therapeutische Effekte in PDO-Modellen von Krebs zu verstehen.

Einleitung

Von Patienten stammende Tumororganoide (PDOs) entwickeln sich schnell zu einem robusten Modellsystem zur Untersuchung der Krebsentwicklung und des therapeutischen Ansprechens. PDOs sind dreidimensionale (3D) Zellkultursysteme, die das komplexe genomische Profil und die Architektur des Primärtumors rekapitulieren 1,2. Im Gegensatz zu herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Kulturen immortalisierter Krebszelllinien erfassen und erhalten PDOs die intratumorale Heterogenität 3,4, was sie zu einem wertvollen Werkzeug sowohl für die mechanistische als auch für die translationale Forschung macht. Obwohl PDOs ein immer beliebteres Modellsystem werden, sind kommerziell erhältliche Reagenzien und Analysemethoden für zelluläre Effekte, die mit PDO-Kulturen kompatibel sind, begrenzt.

Der Mangel an robusten Methoden zur Analyse subtiler Veränderungen des Behandlungsansprechens behindert die klinische Umsetzung. Das Goldstandard-Reagenz für die Zellgesundheit in 3D-Kulturen, CellTiter-Glo 3D, verwendet den ATP-Spiegel als Determinante für die Zellviabilität 5,6. Obwohl dieses Reagenz für Endpunkt-Assays nützlich ist, gibt es mehrere Vorbehalte, vor allem die Unfähigkeit, Proben nach Abschluss des Assays für andere Zwecke zu verwenden.

Die Lebendzellbildgebung ist eine ausgeklügelte Form der kinetischen Mikroskopie, die in Kombination mit fluoreszierenden Reagenzien in der Lage ist, eine Vielzahl von Messwerten für die Zellgesundheit innerhalb von PDO-Modellen zu quantifizieren, einschließlich Apoptose 7,8,9 und Zytotoxizität10. In der Tat war die Bildgebung lebender Zellen ein wesentlicher Bestandteil des Hochdurchsatz-Screenings von Verbindungen in 2D-Plattformen11,12. Systeme wie der Incucyte haben die Technologie erschwinglich und damit für Forschungsgruppen in einer Vielzahl von Umgebungen zugänglich gemacht. Die Anwendung dieser Systeme zur Analyse von 3D-Kulturen steckt jedoch noch in den Kinderschuhen.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Bewertung des Ansprechens auf Medikamente in PDO-Modellen von Krebs unter Verwendung von Multiplex-Lebendzell-Bildgebung (Abbildung 1). Durch die Analyse von Hellfeldbildern können Veränderungen der PDO-Größe und -Morphologie kinetisch überwacht werden. Darüber hinaus können zelluläre Prozesse gleichzeitig im Zeitverlauf mit fluoreszierenden Reagenzien wie Annexin V Red Dye für Apoptose und Cytotox Green Dye für Zytotoxizität quantifiziert werden. Die vorgestellten Methoden sind für das Lebendzell-Bildgebungssystem Cytation 5 optimiert, aber dieses Protokoll kann an verschiedene Lebendzell-Bildgebungsplattformen angepasst werden.

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Protokoll

Studien mit menschlichen Tumorproben wurden vom University of Iowa Institutional Review Board (IRB), Protokoll #201809807, überprüft und genehmigt und in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, wie sie in der Helsinki-Erklärung von 1964 und ihren späteren Änderungen festgelegt sind. Die Einverständniserklärung wurde von allen an der Studie teilnehmenden Probanden eingeholt. Einschlusskriterien sind unter anderem die Diagnose Krebs und die Verfügbarkeit von Tumorproben.

1. Plattieren intakter PDOs in einer 96-Well-Platte

  1. Reagenzien vorbereiten.
    1. 96-Well-Platten über Nacht auf 37 °C vorheizen und BME über Nacht auf 4 °C auftauen.
    2. Bereiten Sie vollständige Organoid-Nährmedien vor, die für die Kultivierung des interessierenden Krebstyps optimiert sind. Spezifische Nährmedien, die für die hierin gezeigten Experimente verwendet werden, sind in der ergänzenden Tabelle 1 angegeben.
      HINWEIS: Medienkomponenten müssen möglicherweise für verschiedene Tumorarten modifiziert werden. Zum Beispiel wird das Organoid-Kulturmedium mit 100 nM Östradiol für gynäkologische Tumoren ergänzt13. Vorbereitete Medien sind 1 Monat lang bei 4 °C stabil. Für die Langzeitlagerung aliquotieren Sie das Medium in 50-ml-Röhrchen und lagern Sie es bei -20 °C.
  2. Bereiten Sie zwei separate Aliquots von Organoid-Nährmedien bei 4 °C und 37 °C vor. Wenn beispielsweise 60 Wells in einer 96-Well-Platte plattiert werden, verwenden Sie 6 ml warme Organoid-Nährmedien und 150 μl eiskalte Organoid-Nährmedien.
  3. Organoid-Waschpuffer vorbereiten: Ergänzen Sie 1x PBS mit 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA und 10 μM Y-27632. Bei 4 °C lagern
  4. Ernten Sie g.U., die in einer 24-Well-Platte kultiviert werden. Führen Sie alle Schritte auf Eis oder bei 4 °C durch, sofern nicht anders angegeben.
    1. Saugen Sie Medien aus jeder Vertiefung mit einem Vakuumleitungssystem an.
    2. Fügen Sie 500 μl eiskalten Organoid-Waschpuffer hinzu und pipettieren Sie vorsichtig 2-3x mit einer 1000-μl-Pipette. Den Teller 10 Minuten auf Eis ausbrüten.
    3. Übertragen Sie den Inhalt jedes Wells in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Um sicherzustellen, dass alle PDOs in Suspension sind, spülen Sie jede Vertiefung mit zusätzlichen 300 μl Organoid-Waschpuffer und geben Sie sie in das konische 50-ml-Röhrchen. 5 min bei 350 x g bei 4 °C zentrifugieren
    4. Saugen Sie den Überstand aus dem BME/Organoid-Pellet mit einem Vakuumleitungssystem an und lassen Sie ~ 5 ml im Röhrchen. Fügen Sie 20 ml Organoid-Waschpuffer hinzu und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit einer serologischen 10-ml-Pipette. 10 Minuten auf Eis inkubieren.
    5. 5 min bei 350 x g bei 4 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand mit einem Vakuumleitungssystem an und achten Sie darauf, das PDO-Pellet nicht zu stören.
  5. Plattieren von PDOs in einer 96-Well-Platte: Führen Sie alle Schritte auf Eis durch, sofern nicht anders angegeben.
    1. Resuspendieren Sie das PDO-Pellet in einer geeigneten Menge eiskalter Organoid-Nährmedien, um eine PDO-Suspension herzustellen. Übertragen Sie die PDO-Suspension in ein eiskaltes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Um die Menge der Organoid-Nährmedien zu berechnen, bestimmen Sie die Anzahl der Wells, die in einer 96-Well-Platte plattiert werden sollen, wobei zu berücksichtigen ist, dass PDOs in einer 5-μl-Kuppel in einem Verhältnis von 1:1 aus Organoid-Kulturmedien und BME plattiert werden. Wenn Sie beispielsweise eine 96-Well-Platte plattieren und nur die inneren 60 Wells verwenden, beträgt die benötigte Gesamtmenge an PDO-Suspension 300 μl: 150 μl Organoid-Nährmedien und 150 μl BME. Bei Modellen, die ein optimales Wachstum bei unterschiedlichen BME-Prozentsätzen aufweisen, kann das Verhältnis von BME:Medien in diesem Schritt modifiziert werden, obwohl es wichtig ist, das Verhältnis über alle Assays für jedes spezifische Modell zu standardisieren. Um Pipettierfehler zu berücksichtigen, fügen Sie jeder Komponente 10 % Volumen hinzu.
    2. Zählen Sie die Anzahl der PDOs.
      1. 2,5 μl der PDO-Suspension in ein eiskaltes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben und mit 2,5 μl BME mischen. Übertragen Sie die 5-μl-Mischung auf einen sauberen Glasobjektträger. Decken Sie den Objektträger nicht ab. Die Mischung verfestigt sich zu einer Kuppel.
      2. Visualisieren Sie mit einem Hellfeldmikroskop bei 4x. Zählen Sie die Anzahl der g.U. in der 5-μl-Mischung; das Ziel ist es, etwa 25-50 PDOs pro 5-μl-Dom zu haben.
        Anmerkungen: Wenn die gewünschte Dichte in der Testmischung nicht erreicht wird, passen Sie das Endvolumen der PDO-Suspension an, indem Sie entweder mehr Organoid-Nährmedien hinzufügen oder die PDO-Suspension zentrifugieren und das PDO-Pellet in einem geringeren Volumen eiskalter Organoid-Nährmedien resuspendieren. Unabhängig davon, wie die PDO-Suspension in diesem Schritt modifiziert wird, ist das endgültige Verhältnis von BME: PDO-Suspension in Schritt 1.5.3. sollte 1:1 sein.
    3. Mischen Sie die PDO-Suspension mit einer 200-μl-Pipette mit breiten Bohrungsspitzen vorsichtig mit einer gleichen Menge BME, um ein Verhältnis von 1:1 von Organoid-Nährmedien zu BME zu erreichen. Vermeiden Sie Blasen, die die Integrität der Kuppeln stören.
    4. Mit einer 20-μl-Pipettore 5-μl-Dome in die Mitte jedes Wells einer vorgewärmten 96-Well-Platte säen und nur die inneren 60 Wells aussäen. Um eine gleichmäßige Verteilung der PDOs zu gewährleisten, pipettieren Sie den Inhalt des 1,5-ml-Röhrchens regelmäßig mit einer 200-μl-Pipette mit breiten Spitzen.
    5. Nachdem alle Vertiefungen ausgesät wurden, den Deckel auf die Platte legen und vorsichtig umdrehen. Inkubieren Sie die umgekehrte Platte bei 37 °C für 20 Minuten im Gewebekultur-Inkubator, damit sich die Kuppeln verfestigen können.
      HINWEIS: Durch das Umdrehen der Platte wird sichergestellt, dass die BME/Organoid-Nährmedienkuppel die 3D-Struktur beibehält, um ausreichend Platz für die PDO-Bildung zu bieten.
    6. Die Platte so umdrehen, dass sie mit offenem Deckel sitzt, und 5 Minuten bei 37 °C inkubieren.

2. Behandlungen und Zugabe von Fluoreszenzfarbstoffen für das Multiplexing

  1. Während sich die BME-Kuppeln in den 96-Well-Platten verfestigen, bereiten Sie Verdünnungen von fluoreszierenden Reagenzien für die Bildgebung lebender Zellen vor. Spezifische Parameter für das Multiplexing von Annexin V Red Dye und Cytotox Green Dye sind hierin angegeben.
  2. Vorbereitung des Fluoreszenzreagenzes (Tag -1): Berechnen Sie das geeignete Volumen der Organoid-Nährmedien basierend auf der Anzahl der zu behandelnden Wells, wobei davon ausgegangen wird, dass jedes Well mit 100 μl farbstoffdosiertem Medium behandelt wird. Farbstoff in vorgewärmten Organoid-Nährmedien auf die gewünschte Konzentration verdünnen.
    HINWEIS: Die Gesamtmenge der benötigten Medien variiert je nach Experiment. Fügen Sie dem Endvolumen 10 % hinzu, um Pipettierfehler auszugleichen. Um beispielsweise die inneren 60 Wells einer 96-Well-Platte zu behandeln, bereiten Sie 6,6 ml farbstoffdosiertes Medium vor (Tabelle 1).
  3. Behandeln Sie jede Vertiefung mit 100 μl 2x farbstoffdosiertem Organoid-Kulturmedium. Geben Sie 200 μl steriles 1x PBS in die äußeren leeren Vertiefungen der Platte. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
    HINWEIS: PBS in den peripheren Vertiefungen verringert die Verdunstung von Medien aus den inneren Vertiefungen.
  4. Zugabe von Arzneimitteln/Behandlungsmitteln (Tag 0): Bereiten Sie Arzneimittel in vorgewärmten Organoid-Nährmedien in einer 2-fachen Konzentration in einem Volumen von 100 μl pro Vertiefung vor.
    HINWEIS: DMSO kann in hohen Konzentrationen für Zellen toxisch sein. Eine Konzentration von 0,1 % DMSO wird in den in dieser Studie durchgeführten Experimenten nicht überschritten. Zusätzlich zu Medikamenten werden einige fluoreszierende Reagenzien als DMSO-Lösung verteilt. Es ist wichtig, die Gesamt-DMSO-Konzentration bei der Arbeit mit solchen Reagenzien zu berücksichtigen.
  5. Geben Sie 100 μl 2x farbstoffdosiertes Medium in jede Vertiefung; Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.

3. Einrichten von Bildgebungsparametern

  1. Platte in Zytation 5 legen. Offen Gen5-Software. Klicken Sie > manuellen Imager-Modus auf Neue Aufgabe. Wählen Sie Jetzt aufnehmen und geben Sie die folgenden Einstellungen ein: Objektiv (gewünschte Vergrößerung auswählen); Filter (Mikroplatte auswählen); Mikroplattenformat (wählen Sie die Anzahl der Wells); und Behältertyp (Plattentyp auswählen). Klicken Sie auf Deckel verwenden und Langsamere Trägergeschwindigkeit verwenden. Klicken Sie auf OK.
    HINWEIS: Gefäßtyp: Seien Sie bei der Auswahl von Informationen über die Platte so genau wie möglich, da die Software für jeden Plattentyp und jede Dicke des Kunststoffs auf den spezifischen Abstand vom Objektiv zur Unterseite der Platte kalibriert ist.
    Langsamere Trägergeschwindigkeit: Aktivieren Sie dieses Kontrollkästchen, um eine Unterbrechung der Kuppeln beim Be- und Entladen von Platten zu vermeiden.
  2. Erstellen Sie einen Z-Stapel, der die gesamte BME-Kuppel abbildet.
    1. Wählen Sie ein Well of Interest aus, das angezeigt werden soll (linkes Feld, unter dem Histogramm).
    2. Wählen Sie den Hellfeldkanal (linkes Bedienfeld, oben). Klicken Sie auf Automatisch belichten und passen Sie die Einstellungen nach Bedarf an.
    3. Legen Sie den unteren und oberen Rand des Z-Stapels fest: Erweitern Sie die Registerkarte "Imaging-Modus " (linker Bereich, Mitte). Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Z-Stapel . Klicken Sie mit den Kursanpassungspfeilen (linker Bereich, Mitte) auf die Abwärtseinstellung, bis alle PDOs unscharf und unscharf geworden sind. Legen Sie dies als unteren Rand des Z-Stapels fest. Wiederholen Sie den Vorgang in die entgegengesetzte Richtung, indem Sie die Kursanpassungspfeile verwenden, um die Oberseite des Z-Stapels festzulegen.
    4. Um sicherzustellen, dass die Z-Stapel-Einstellungen für andere Wells von Interesse geeignet sind, wählen Sie ein anderes Well-Feld aus (linker Bereich, unter dem Histogramm) und visualisieren Sie die Ober- und Unterseite des Z-Stapels.
    5. Um die Fokuspositionen manuell einzugeben, klicken Sie auf die drei Punkte neben der Feineinstellung (linkes Feld, oben). Es öffnet sich ein Fenster; Geben Sie den obersten Z-Stapel-Wert ein (im linken Bereich in der Mitte unter Imaging-Modus). Wiederholen Sie den Vorgang für den unteren Z-Stapel-Wert. Passen Sie nach Bedarf an, um den gewünschten Z-Bereich zu erfassen, indem Sie Schritt 3.2.3 wiederholen. Wenn Anpassungen erforderlich waren, wählen Sie ein anderes Well aus, um die Einstellungen zu überprüfen.
  3. Legen Sie die Belichtungseinstellungen für die Leuchtstoffkanäle fest. Die Einstellungen sind für zwei Leuchtstoffkanäle (GFP & TRITC) beschrieben. Die genaue Anzahl der Fluoreszenzkanäle hängt vom Experiment ab und davon, welche Fluoreszenzwürfel im Lebendzell-Bildgebungssystem installiert sind.
    HINWEIS: Wenn die Signalintensität am Ende des Experiments voraussichtlich deutlich höher ist, sollten Benutzer Testexperimente durchführen, um die optimalen Belichtungseinstellungen am Ende des Experiments zu bestimmen, die dann bei der Einrichtung der Anfangsparameter angewendet werden können.
    1. Erweitern Sie die Registerkarte Imaging-Modus (linker Bereich, Mitte) und öffnen Sie Imaging-Schritt bearbeiten. Ein Popup-Fenster wird angezeigt.
    2. Klicken Sie unter Kanäle auf die Blase für die gewünschte Anzahl von Kanälen. Legen Sie einen Kanal für das Hellfeld und zusätzliche Kanäle für jeden Fluoreszenzkanal fest. In diesem Beispiel ist Kanal 1 = Hellfeld; Kanal 2 = GFP; Kanal 3 = TRITC. Wählen Sie in den Dropdown-Menüs Farbe die entsprechende Einstellung für jeden Kanal aus. Schließen Sie das Bearbeitungsfenster, indem Sie auf OK klicken.
    3. Richten Sie jeden fluoreszierenden Kanal ein.
      1. Schalten Sie den Kanal auf GFP um (linkes Feld, oben).
      2. Klicken Sie auf Automatisch belichten (linker Bereich, oben). Erweitern Sie die Registerkarte Belichtung (linkes Bedienfeld, Mitte) und passen Sie die Belichtungseinstellungen an, um das Hintergrundsignal zu minimieren.
      3. Kopieren Sie die Belichtungseinstellungen auf die Registerkarte Bildmodus , indem Sie die Schritte 3.3.3.3-3.3.3.6 ausführen.
      4. Klicken Sie auf das Symbol Kopieren neben dem Feld Imaging-Schritt bearbeiten . Klicken Sie auf Imaging-Schritt bearbeiten, um ein weiteres Fenster zu öffnen.
      5. Klicken Sie unter dem GFP-Kanal auf das Symbol Zwischenablage in der Zeile Belichtung , um dem Kanal die Einstellungen für Beleuchtung, Integrationszeit und Kameraverstärkung hinzuzufügen.
      6. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.3.4-3.3.3.5 für den TRITC-Kanal. Klicken Sie auf OK , um das Fenster zu schließen.
  4. Richten Sie die Bildvorverarbeitungs- und Z-Projektionsschritte ein, um die Bildvorverarbeitung zu automatisieren.
    1. Klicken Sie auf das Kamerasymbol (linkes Feld, untere Ecke). Es öffnet sich ein neues Fenster.
    2. Klicken Sie unter Verarbeitungsschritt hinzufügen (linker Bereich, unten) auf Bildvorverarbeitung. Es öffnet sich ein neues Fenster.
    3. Deaktivieren Sie auf der Registerkarte Hellfeld die Option Bildvorverarbeitung anwenden.
    4. Stellen Sie sicher, dass für jede Registerkarte "Fluoreszenzkanal " die Option "Bildvorverarbeitung anwenden" ausgewählt ist. Deaktivieren Sie Dieselben Optionen wie Kanal 1 verwenden und klicken Sie auf OK. Das Fenster wird geschlossen.
    5. Klicken Sie unter Verarbeitungsschritt hinzufügen auf Z-Projektion. Es öffnet sich ein neues Fenster. Passen Sie bei Bedarf den Slice-Bereich an (z. B. um den Z-Bereich einzugrenzen). Schließen Sie das Fenster, indem Sie OK auswählen.
  5. Protokoll erstellen.
    1. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Bildsatz . Klicken Sie im Dropdownmenü auf Experiment aus diesem Bildsatz erstellen. Das Imaging-Fenster wird geschlossen und das Prozedurfenster wird geöffnet.
      HINWEIS: Die im manuellen Imager-Modus ausgewählten Parameter werden automatisch in das neue Fenster geladen, wodurch ein experimentelles Protokoll erstellt werden kann.
    2. Temperatur und Farbverlauf einstellen: Klicke unter der Überschrift "Aktionen" (links) auf "Temperatur einstellen". Es öffnet sich ein neues Fenster. Wählen Sie Inkubator Ein und geben Sie die gewünschte Temperatur manuell unter Temperatur ein. Geben Sie als Nächstes unter Farbverlauf manuell 1 ein. Schließen Sie das Fenster, indem Sie OK auswählen.
      Anmerkungen: Durch die Erzeugung eines Gradienten von 1 °C wird verhindert, dass sich Kondenswasser auf dem Deckel der Platte bildet.
    3. Weisen Sie dem Bild Vertiefungen zu.
      1. Doppelklicken Sie unter Beschreibung auf den Bildschritt. Klicken Sie auf Vollplatte (rechte Ecke, oben). Dadurch wird das Fenster Plattenlayout geöffnet.
      2. Markieren Sie interessante Vertiefungen mit dem Cursor. Klicken Sie auf OK. Aktivieren Sie bei Bedarf die Kontrollkästchen "Autofokus-Binning " und " Binning erfassen ". Klicken Sie auf OK , um das Fenster zu schließen.
        HINWEIS: Das Binning erfordert eine Belichtungsanpassung, wie in Schritt 3.3.3.2 oben beschrieben. Im Abschnitt "Diskussion" finden Sie spezifische Szenarien, in denen diese Funktion verwendet werden kann.
    4. Legen Sie Intervalle für die kinetische Bildgebung fest.
      1. Klicken Sie auf Optionen unter der Überschrift Andere (links). Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Diskontinuierliches kinetisches Verfahren .
      2. Geben Sie unter Geschätzte Gesamtzeit die Laufzeit für das Experiment ein (z. B. 5 Tage). Geben Sie unter Geschätztes Intervall das Intervall ein, in dem die Platte abgebildet werden soll (z. B. alle 6 h).
      3. Klicken Sie nach jedem Durchlauf auf Pause , damit die Platte in den Inkubator übertragen werden kann. Schließen Sie das Fenster, indem Sie OK auswählen.
    5. Aktualisieren Sie die Schritte zur Datenreduzierung.
      1. Klicken Sie auf OK , um das Prozedurfenster zu schließen. Es öffnet sich eine Registerkarte, auf der Sie die Schritte zur Datenreduzierung aktualisieren können. Wählen Sie Ja aus. Doppelklicken Sie auf Bildvorverarbeitung. Klicken Sie sich durch die verschiedenen Kanäle, um die Einstellungen zu überprüfen, und klicken Sie auf OK.
      2. Doppelklicken Sie auf Z-Projektion. Klicken Sie sich durch die verschiedenen Kanäle, um die Einstellungen zu überprüfen. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie dann erneut auf OK , um das Datenreduzierungsfenster zu schließen.
    6. Formatieren Sie das Plattenlayout.
      1. Öffnen Sie den Plattenlayout-Assistenten, und legen Sie die Well-Typen fest, indem Sie die Schritte 3.6.2 bis 3.6.3 ausführen.
      2. Klicken Sie auf das Symbol Plattenlayout in der Symbolleiste (linke Ecke, oben), um den Plattenlayout-Assistenten zu öffnen.
      3. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen neben den im Experiment verwendeten Well-Typen. Geben Sie unter Assay-Kontrollen die Anzahl der verschiedenen Kontrolltypen mit den Pfeilen ein. Klicken Sie auf Weiter , um das Fenster Assay Control #1 zu öffnen.
      4. Legen Sie die Bedingungen für die Assay-Kontrollbohrung gemäß den Schritten 3.6.5-3.6.8 fest.
      5. Geben Sie im Fenster Assay Control #1 die Kontrollbeschriftung in das Feld Plate Layout ID ein. Geben Sie bei Bedarf den vollständigen Namen in das nebenstehende Feld ein. Wählen Sie die Anzahl der Replikationen für die jeweilige Kontrollbedingung mit den Pfeilen aus.
      6. Wenn Sie mehrere Konzentrationen oder eine Verdünnungsreihe innerhalb des Steuerelements verwenden, klicken Sie auf Verdünnungen/Konzentrationen definieren und wählen Sie im Dropdown-Menü den Typ aus. Geben Sie die Werte für jede Konzentration/Verdünnung in die Tabelle ein.
        HINWEIS: Die Auto-Funktion kann verwendet werden, wenn sich die Konzentrationen in einem gleichmäßigen Inkrement ändern.
      7. Wählen Sie die Registerkarte Farbe in der Symbolleiste aus. Wählen Sie die gewünschte Textfarbe und Hintergrundfarbe für die Steuerung im Dropdown-Menü. Klicken Sie auf Weiter.
      8. Wiederholen Sie dies bei Bedarf mit zusätzlichen Steuerelementen.
      9. Legen Sie die Bedingungen für die Probenvertiefung gemäß 3.6.10-3.6.12 fest.
      10. Geben Sie auf der Seite Beispieleinrichtung das Beispiel-ID-Präfix ein (z. B. SPL). Wählen Sie die Anzahl der Replikationen mit den Pfeilen aus. Wenn Sie Proben mit unterschiedlichen Behandlungskonzentrationen verwenden, wählen Sie Konzentrationen oder Verdünnungen im Dropdown-Menü Typ . Geben Sie Verdünnungen/Konzentrationen in die Tabelle ein und geben Sie Einheiten in das Feld Einheit ein.
      11. Wählen Sie Identifikationsfelder in der Symbolleiste aus. Geben Sie den /die gewünschte(n) Kategoriename(n) (z.B. Proben-ID, Medikament) in die Tabelle ein.
      12. Wählen Sie die Registerkarte Farbe in der Symbolleiste. Wählen Sie für jede Behandlungsgruppe/Probe eine andere Farbe. Klicken Sie auf Fertig stellen. Dadurch wird die Seite Plattenlayout geöffnet.
        HINWEIS: Die Zahlen auf der linken Seite korrelieren mit den verschiedenen Probennummern.
      13. Weisen Sie Beispiel-IDs zu, indem Sie die Schritte 3.6.14-3.6.16 ausführen.
      14. Auswählen SPL1 aus dem linken Bereich. Verwenden Sie den Cursor, um Wells auszuwählen.
        HINWEIS: Die Werkzeuge für die automatische Auswahl können im Feld für die Serienzuweisung angepasst werden. Die Anzahl der Replikate und die Ausrichtung des Layouts können vorgegeben werden.
      15. Wiederholen Sie den Vorgang mit anderen Proben, um das Plattenlayout zu vervollständigen. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf OK.
      16. Wählen Sie in der Symbolleiste Datei die Option Beispiel-IDs aus. Füllen Sie die Spalten der Proben-ID mit den entsprechenden Informationen für jede Probe aus (z. B. Arzneimitteltyp). Drücken Sie OK.
    7. Speichern Sie das Protokoll.
      1. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Datei > Protokoll speichern unter. Wählen Sie den Speicherort für die Datei aus. Geben Sie einen Dateinamen ein. Klicken Sie auf Speichern, um das Fenster zu schließen.
      2. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Datei > Beenden . Es öffnet sich eine Registerkarte, auf der Sie Änderungen am manuellen Imager-Modus speichern können. Wählen Sie Nein aus.
      3. Es öffnet sich eine Registerkarte, auf der Sie die Änderungen an Experiment 1 speichern können. Wählen Sie Nein aus. Es öffnet sich eine Registerkarte, auf der Sie die Protokolldefinition aktualisieren können. Wählen Sie Aktualisieren aus. Schließen Sie die Software.
  6. Importieren Sie das Protokoll in BioSpa OnDemand und schließen Sie die Einrichtung des Experiments ab.
    1. Öffnen Sie die Software BioSpa OnDemand (Planungssoftware).
    2. Wählen Sie einen freien Steckplatz in der Software aus.
    3. Entfernen Sie die Platte aus dem Lebendzell-Bildgebungssystem. Klicken Sie auf Schublade öffnen , um auf den entsprechenden Steckplatz in der Planungssoftware zuzugreifen und die Platte einzusetzen. Klicken Sie auf Schublade schließen.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann jederzeit ausgeführt werden, nachdem das Protokoll in Schritt 3.5.7 oben erstellt wurde. Die Platte muss sich jedoch in der Cytation 5 befinden, um einen Zeitmesslauf in Schritt 3.6.4.3 durchzuführen.
    4. Importieren Sie das Protokoll.
      1. Wählen Sie auf der Registerkarte Verfahrensinformationen im Dropdown-Menü Benutzer aus. Klicken Sie neben dem Protokollslot auf Auswählen > Neuen Eintrag hinzufügen.
      2. Klicken Sie neben dem Protokollsteckplatz auf Auswählen. Dadurch wird ein neues Fenster geöffnet, in dem Sie zum gewünschten Protokoll in der Dateiarchitektur navigieren können. Klicken Sie auf Öffnen , um das Protokoll in die Planungssoftware zu importieren.
      3. Geben Sie die Zeit ein, die für die Abbildung der Platte benötigt wird. Klicken Sie auf OK , um das Fenster Gen5-Protokollliste zu schließen.
        HINWEIS: Dieser Schritt ist besonders wichtig, wenn mehrere Experimente gleichzeitig ausgeführt werden. Um die Zeit zu bestimmen, die für das Image benötigt wird, klicken Sie auf Jetzt einen Timing-Lauf durchführen. Klicken Sie auf OK.
    5. Legen Sie Bildgebungsintervalle fest und planen Sie das Experiment.
      1. Geben Sie unter Intervall das in Schritt 3.5.4 festgelegte Imaging-Intervall ein.
      2. Wählen Sie unter Startzeitoptionen die Option Wenn verfügbar aus. Wählen Sie unter Dauer die Option Fest oder Fortlaufend aus.
        HINWEIS: Es kann eine bestimmte Startzeit festgelegt werden, anstatt das Protokoll zum nächsten verfügbaren Zeitpunkt auszuführen. Wenn Sie Feste Dauer auswählen, wird ein bestimmter Endpunkt für das Experiment festgelegt und der Benutzer muss einen experimentellen Zeitrahmen festlegen. Die kontinuierliche Dauer ermöglicht die Ausführung des Experiments ohne Endpunkt und kann nur beendet werden, indem ein Benutzer das Experiment beendet.
      3. Klicken Sie auf Planplatte/Schiff. Dadurch wird die Plattenvalidierungssequenz geöffnet. Es öffnet sich eine Registerkarte mit der vorgeschlagenen ersten Lesezeit. Klicken Sie auf Ja , um diesen Zeitplan zu akzeptieren.

4. Bildanalyse in Gen5-Software (Abbildung 2)

  1. Öffnen Sie das Bildanalysemodul.
    1. Öffnen Sie Gen5. Wählen Sie im Task-Manager Experimente > Öffnen aus. Wählen Sie das Experiment aus, um die Datei zu öffnen. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Platte > Ansicht.
    2. Ändern Sie das Dropdown-Menü Daten in Z-Projektion. Doppelklicken Sie auf eine Quelle von Interesse. Wählen Sie Analysieren aus, > ich einen neuen Schritt zur Datenreduzierung der Bildanalyse einrichten möchte. Klicken Sie auf OK.
  2. Zelluläre Analyse
    1. Primäre Maske
      1. Wählen Sie unter Analyseeinstellungen die Option Typ: Mobilfunkanalyse und Erkennungskanal: ZProj[Tsf[Hellfeld]] (linker Bereich, Mitte).
      2. Klicken Sie auf Optionen. Dadurch wird die Seite Primäre Maske und Anzahl geöffnet. Aktivieren Sie im Feld Schwellenwert die Option Auto und klicken Sie auf Übernehmen. Klicken Sie auf das Feld Objekte hervorheben (rechter Bereich, unten), um Objekte innerhalb des festgelegten Schwellenwerts anzuzeigen. Passen Sie bei Bedarf an, um Objekte von Interesse einzubeziehen.
        HINWEIS: Die Schwellenwerteinstellungen basieren auf der Pixelintensität. Wenn der Schwellenwert beispielsweise auf 5000 festgelegt ist, werden Pixel mit einer Intensität von mehr als 5000 in die Analyse einbezogen.
      3. Legen Sie unter Objektauswahl die minimale und maximale Objektgröße (μm) fest. Passen Sie bei Bedarf an, um Zelltrümmer/einzelne Zellen auszuschließen.
        HINWEIS: Die PDO-Größe kann je nach Modell und Typ erheblich variieren. Verwenden Sie das Messwerkzeug in der Gen5-Software, um die minimalen und maximalen PDO-Größenschwellenwerte für jedes Modell zu bestimmen. Benutzer können einen kleineren Mindestschwellenwert für die PDO-Größe im Verhältnis zu dem vom Messwerkzeug angegebenen Wert wählen, um den Ausschluss von PDO-Fragmenten zu einem späteren Zeitpunkt nach der medikamentösen Behandlung zu verhindern.
      4. Um die Analyse auf einen bestimmten Bereich des Wells zu beschränken, deaktivieren Sie die Option Gesamtes Bild analysieren und klicken Sie auf Stecken. Verwenden Sie im Fenster "Image Plug " das Dropdown-Menü, um Plug-Form auszuwählen . Passen Sie die Größen- und Positionsparameter nach Bedarf an den gewünschten Bereich an.
        HINWEIS: Es ist wichtig, die Anzahl der PDOs innerhalb des Plugs zu maximieren und gleichzeitig PDO-freie Bereiche auszuschließen, um den Hintergrund zu minimieren. Legen Sie eine Plug-Größe fest, die die Mehrheit der interessierenden Objekte über Replikate hinweg konsistent erfasst. Es ist wichtig, einen Stopfen zu erzeugen, der auch die Kanten der Kuppel ausschließt, da er alle Objekte ausschließt, die aufgrund der Lichtbrechung durch die extreme Krümmung der Kuppel an den Rändern verzerrt erscheinen könnten. Primäre Kantenobjekte einschließen können auch deaktiviert werden, um nur ganze PDOs innerhalb des Plugs zu erfassen.
    2. Subpopulationsanalyse. Ein Beispiel für die Ausweisung von Teilpopulationen ist in Abbildung 3 dargestellt.
      1. Klicken Sie in der Symbolleiste Mobilfunkanalyse auf Berechnete Metriken. Klicken Sie auf Relevante Metriken auf Objektebene auswählen oder erstellen (rechte Ecke, unten). Wählen Sie unter Metriken für verfügbare Objekte die gewünschten Metriken aus (z. B. Zirkularität) und klicken Sie auf die Schaltfläche Einfügen. Klicken Sie auf OK.
        HINWEIS: Die Morphologie und Dichte jedes PDO-Modells bestimmt die besten Metriken von Interesse zur Unterscheidung der Subpopulation.
      2. Klicken Sie in der Symbolleiste Zellanalyse auf Subpopulationsanalyse. Klicken Sie auf Hinzufügen, um eine neue Teilpopulation zu erstellen. Es öffnet sich ein Popup-Fenster.
      3. Geben Sie bei Bedarf einen Namen für die Teilpopulation ein. Wählen Sie unter Objektmetriken eine gewünschte Metrik aus und klicken Sie auf Bedingung hinzufügen. Geben Sie im Fenster Bedingung bearbeiten Parameter für die ausgewählte Objektmetrik ein. Wiederholen Sie dies bei Bedarf mit zusätzlichen Metriken.
        HINWEIS: Die Parameter können manuell angepasst oder mit dem Sucherwerkzeug eingestellt werden. Um beispielsweise Schmutz auszuschließen, können Benutzer Fläche als Objektmetrik hinzufügen und Objekte auswählen, die kleiner als 800 sind. Zirkularität als Objektmetrik wird routinemäßig verwendet, und je nach Modell sind alle Objekte mit einer Rundheit von mehr als 0,2 bis 0,5 enthalten.
      4. Aktivieren Sie in der Tabelle unten im Fenster die gewünschten Ergebnisse, die angezeigt werden sollen. Klicken Sie auf OK > Übernehmen.
      5. Um die Objekte innerhalb der Teilauffüllung anzuzeigen, verwenden Sie das Dropdown-Menü Objektdetails (rechter Bereich, Mitte), um die Teilauffüllung auszuwählen. Objekte, die unter die Parameter fallen, werden im Bild hervorgehoben.
        HINWEIS: Um die Hervorhebungsfarben der primären Maske und der Unterfüllung zu ändern, klicken Sie auf Einstellungen (rechter Bereich, unten).
      6. Um die Parameter für Teilpopulationen anzupassen, öffnen Sie das Fenster Teilpopulationsanalyse erneut über die Werkzeugleiste Zellanalyse . Wählen Sie die Teilpopulation aus und klicken Sie auf Bearbeiten. Klicken Sie auf Schritt hinzufügen.
        HINWEIS: Dadurch wird die gleiche Analyse auf alle Vertiefungen innerhalb des Experiments zu allen Zeitpunkten angewendet. Im Dropdown-Menü auf der Seite Matrix können verschiedene Metriken für die individuelle Anzeige ausgewählt werden.

5. Exportieren von Daten aus Gen5 nach Excel

  1. Um eine Datendatei für den Export anzupassen, wählen Sie in der Symbolleiste das Symbol Berichts-/Export-Generatoren aus. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Neuer Export nach Excel.
  2. Wählen Sie auf der Seite Eigenschaften des Popupfensters die Option Bereich > Platte und Inhalt > Benutzerdefiniert. Klicken Sie auf die Option Inhalt in der Symbolleiste. Klicken Sie auf Vorlage bearbeiten, um das Excel-Programm zu öffnen.
  3. Wählen Sie in der Tabelle Add-Ins > Tabelle > Well-Daten aus. Bewegen Sie den Mauszeiger über die verschiedenen Auswahlmöglichkeiten, um Optionen für den Export anzuzeigen. Wählen Sie die gewünschte Metrik aus (z. B. Objektmittelwert[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
    HINWEIS: Das Plattenlayout kann der Tabellenkalkulationsanalysevorlage hinzugefügt werden, indem Sie Add-Ins > Protokollzusammenfassung > Layout auswählen.
  4. Ein Bearbeitungsfenster wird geöffnet. Legen Sie im Feld Wells die Wells für den Export entweder mit Well-ID oder Well # fest. Wählen Sie OK aus. Eine Vorlage wird in die Tabellenkalkulationsdatei geladen. Schließen Sie die Tabelle. Die Vorlage wird automatisch gespeichert.
  5. Klicken Sie im Fenster Neuer Export nach Excel auf OK und schließen Sie das Fenster Bericht-/Export-Generatoren.
  6. Klicken Sie auf das Symbol Exportieren in der Gen5-Symbolleiste. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben der gewünschten Exportdatei. Klicken Sie auf OK. Gen5 füllt die Tabellenkalkulationsvorlage automatisch aus und öffnet die Datei in Excel.

6. Externe Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die Exportdatei (.xlsx) in Excel.
  2. Teilen Sie für jedes Welling jeden einzelnen Wert durch den 0:00-Zeitpunktwert für dieses Well. Dadurch wird der Zeitpunkt 0 auf 1 gesetzt, und jeder Wert darüber hinaus ist relativ zum ursprünglichen Messwert.
  3. Öffnen Sie eine neue Datei in der Datenanalysesoftware. Wählen Sie die Option XY-Layout .
    HINWEIS: In diesem Protokoll wurde GraphPad Prism (Version 9.5.1) verwendet.
  4. Eingabebeschriftungen für jede Datengruppe. Kopieren Sie die Zeitpunkte und die entsprechenden normalisierten Werte für jede Behandlungsgruppe und fügen Sie sie in die Prisma-Tabelle ein. Ein Diagramm für die Daten wird automatisch generiert und ist unter Diagramme zu finden.

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Ergebnisse

Unser Ziel war es, die Machbarkeit der Verwendung von Multiplex-Lebendzell-Imaging zur Beurteilung des PDO-Therapieansprechens zu demonstrieren. Proof-of-Concept-Experimente wurden in zwei separaten PDO-Modellen des Endometriumkarzinoms durchgeführt: ONC-10817 und ONC-10811 (siehe ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 2 für ONC-10811-Daten). Apoptose (Annexin-V-Färbung) und Zytotoxizität (Cytotox Green-Aufnahme) wurden als Reaktion auf den Apoptose-induzierenden Wirkstoff...

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Diskussion

PDO-Kulturen werden aufgrund ihrer Fähigkeit, zelluläre Reaktionen und Verhaltensweisen widerzuspiegeln, zu einem immer beliebteren In-vitro-Modellsystem2. Bedeutende Fortschritte wurden bei der Erzeugung, Kultur und Expansion von PDO-Techniken erzielt, aber Methoden zur Analyse therapeutischer Reaktionen hinken hinterher. Kommerziell erhältliche 3D-Viabilitätskits sind lytische Endpunkt-Assays, bei denen potenziell wertvolle Daten zur kinetischen Reaktion fehlen und nachfolgende Analysen durc...

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Offenlegungen

KWT ist Miteigentümer von Immortagen Inc. CJD ist ein Angestellter von Agilent. JSdB war in Beiräten tätig und erhielt Honorare von Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo und Vertex Pharmaceuticals; ist ein Mitarbeiter des Institute of Cancer Research (ICR), das für seine Forschungsarbeit finanzielle oder andere Unterstützung von AZ, Astellas, Bayer, Cellcentric, Daiichi, Genentech, Genmab, GSK, Janssen, Merck Serono, MSD, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Pfizer und Vertex erhalten hat und ein kommerzielles Interesse an Abirateron, PARP-Hemmung bei der DNA-Reparatur defekter Krebsarten, hat, und PI3K/AKT-Signalweghemmer (kein persönliches Einkommen); wurde als Erfinder ohne finanzielles Interesse für das von Janssen eingereichte Patent 8 822 438 genannt, das die Verwendung von Abirateronacetat mit Kortikosteroiden abdeckt; war der CI/PI vieler von der Industrie gesponserter klinischer Studien; und ist Senior Investigator des National Institute for Health Research (NIHR). Keine anderen Autoren haben potenzielle Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken dem Tissue Procurement Core und Dr. Kristen Coleman von der University of Iowa für die Bereitstellung von Tumorproben und Dr. Sofia Gabrilovich in der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie für die Unterstützung bei der PDO-Modellgenerierung. Wir danken auch Dr. Valerie Salvatico (Agilent, USA) für die kritische Analyse des Manuskripts. Wir erkennen die folgenden Finanzierungsquellen an: NIH/NCI CA263783 und DOD CDMRP CA220729P1 an KWT; Cancer Research UK, Prostate Cancer UK, Prostate Cancer Foundation und Medical Research Council an JSdB. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Planung oder Analyse von Experimenten oder der Entscheidung zur Veröffentlichung.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrfuge tubeDot Scientific Inc1008113
15 mL conical centrifuge tubeSarstedt62.554.100
554 NM LED CubeAgilent1225012
96-well plateCorning Costar3596Prewarmed to 37 °C
96-well plateAgilent204626-100Prewarmed to 37 °C
A83-01Tocris2939Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12Gibco12634-010component of organoid culture media
B27 SupplementGibco17504044Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated IncubatorAgilentBIOSPAG-SNTabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode ReaderAgilentCYT5PW-SNPlate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane ExtractR&D SystemsBME001-10
Daunorubicin HClSigma-AldrichS3035Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD2438
EDTA (0.5 M)Thermo FisherAM9260G
ForskolinTocris1099Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
GlutamaxGibco35050-061Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPESGibco15630-080Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant ProteinGibcoAF-100-15-1MGFinal concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant ProteinGibco100-26-1MGFinal concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant ProteinGibco120-38-5UGFinal concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock SolutionStemCell Technologies7926Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFPAgilent1225101
Imaging Filter Cube- TRITCAgilent1225125
Imaging LED GFP/CFPAgilent1225001
Incucyte Annexin V Red DyeSartorius4641Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green DyeSartorius4633DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteineSigma-AldrichA7250Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining SolutionFisher-Scientific13366169Add 1:50 volume
NicotinamideSigma-AldrichN0636Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
NogginR&D Systems6057-NGFinal concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-StreptomycinGibco15140122Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)Gibco14190-144
PrimocinInvivoGenant-pm-05Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1Pepro Tech100-03Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.Sigma-AldrichS6942
TrypLE ExpressLife Technologies12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7Sigma-Aldrich688000Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-EstradiolSigma-AldrichE2758Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)

Referenzen

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