Nicht-invasiver Assay zur Bestimmung der Chlorophyll-Biosynthese-Kinetik in frühen Stadien der Arabidopsis-De-etiolation

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein fortschrittliches Werkzeug zur Überwachung der Chlorophyllbiosynthese in den frühen Stadien der Arabidopsis-Keimlingsentetiolierung. Die neuartige Methodik ermöglicht eine nicht-invasive Echtzeit-Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Zusammenfassung

Die Chlorophyllbiosynthese ist ein Kennzeichen der Entetiolierung, einer der dramatischsten Phasen im Lebenszyklus der Pflanze. Der streng kontrollierte und hochdynamische Prozess der Chlorophyllbiosynthese wird bei Blütenpflanzen beim Übergang vom Dunkeln zum Hellen ausgelöst. In dem Moment, in dem etiolierte Sämlinge den ersten Spuren von Sonnenlicht ausgesetzt sind, wird die schnelle Umwandlung (in Sekundenordnung) von Protochlorophyllid in Chlorophyllid durch einzigartige lichtakzeptierende Proteinkomplexe vermittelt, die über nachfolgende Stoffwechselschritte zur Produktion von voll funktionsfähigem Chlorophyll führen. Zu den Standardtechniken für die Analyse des Chlorophyllgehalts gehört die Pigmentextraktion aus abgelöstem Pflanzengewebe, was für die Untersuchung solch schneller Prozesse nicht gilt. Um die Chlorophyllkinetik in vivo mit hoher Genauigkeit und raumzeitlicher Auflösung in den ersten Stunden nach der lichtinduzierten Deetiolierung zu untersuchen, wurden ein Instrument und ein Protokoll entwickelt. Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren vor, das für eine statistisch robuste Quantifizierung von Chlorophyll in den frühen Stadien der Arabidopsis-De-Etiolierung entwickelt wurde.

Einleitung

Die De-etiolation stellt die dramatischste Phase im Pflanzenlebenszyklus dar, die durch eine Reihe morphologischer Veränderungen und eine vollständige Neuordnung des Pflanzenstoffwechsels (von hetero- zu autotrop) gekennzeichnet ^ist1. Die Chlorophyllbiosynthese ist ein Kennzeichen der lichtinduzierten Entetiolierung in Pflanzen und ein sehr dynamischer Prozess. Die Bildung von Chlorophyll aus dunkel produzierten Vorläufer-Protochlorophyllid muss eng koordiniert werden, um Schäden durch reaktive Nebenprodukte zu vermeiden². Die Protochlorophyllidreduktion zu Chlorophyllid wird durch lichtabhängige Protochlorophyllid-Oxido....

Protokoll

1. Mittlere Zubereitung

1. Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie 0,75 g Geliermittel mit 50 ml sterilem deionisiertem Wasser in einer Glasflasche mischen, um eine Konzentration von 1,5 % (w/v) für eine Petriplatte (120 x 120 x 17 mm) zu erreichen. Schütteln Sie die Mischung vorsichtig und erhitzen Sie sie dann in der Mikrowelle, bis sie kocht, um das Geliermittel aufzulösen (die Lösung wird klar).
2. Lassen Sie das Medium auf 58-60 °C abkühlen, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren. Alle nachfolgenden Schritte müssen unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um eine Kontamination zu verm....

Diskussion

Kritische Schritte des Protokolls und Fehlerbehebung - kein Licht und kümmern Sie sich um die Maske
Wie direkt in der obigen Protokollbeschreibung hervorgehoben, ist es von entscheidender Bedeutung, selbst Spuren von Licht sowohl während der Kultivierung von etiolierten Pflanzensämlingen als auch kurz vor Beginn des Protokolls zu vermeiden¹¹. In unserem Aufbau verwenden wir eine spezielle dunkle Kammer, die sich im begehbaren Phytotron befindet und durch eine lichtdichte Dre.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Aluminum foil	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds	NASC collection	N1092
Cultivation chamber	PSI		custom made
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM device	PSI		custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Laminar-flow box	UniGreenScheme	ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND	Merck	BR780546-500EA
Micropore tape	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented	Merck	Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen	Merck	AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software	PSI		delivered as a part of the iReenCAM