Differenzierung der Abstammungslinien des enterischen Nervensystems von humanen pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Die Ableitung von Abstammungslinien des enterischen Nervensystems (ENS) aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) bietet eine skalierbare Zellquelle zur Untersuchung der ENS-Entwicklung und -Krankheit sowie zur Verwendung in der regenerativen Medizin. Hier wird ein detailliertes in vitro Protokoll zur Gewinnung enterischer Neuronen aus hPSCs unter chemisch definierten Kulturbedingungen vorgestellt.

Zusammenfassung

Das menschliche enterische Nervensystem (ENS) ist ein großes Netzwerk von glialen und neuronalen Zelltypen mit einer bemerkenswerten Vielfalt an Neurotransmittern. Das ENS steuert die Darmmotilität, die Enzymsekretion und die Nährstoffaufnahme und interagiert mit dem Immunsystem und dem Darmmikrobiom. Folglich sind entwicklungsbedingte und erworbene Defekte des ENS für viele menschliche Krankheiten verantwortlich und können zu Symptomen der Parkinson-Krankheit beitragen. Einschränkungen bei Tiermodellsystemen und beim Zugang zu primärem Gewebe stellen bei Studien des humanen ENS eine erhebliche experimentelle Herausforderung dar. In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für eine effektive in vitro Gewinnung der ENS-Linien aus humanen pluripotenten Stammzellen, hPSC, unter definierten Kulturbedingungen vorgestellt. Unser Protokoll beginnt mit der gerichteten Differenzierung von hPSCs zu enterischen Neuralleistenzellen innerhalb von 15 Tagen und liefert innerhalb von 30 Tagen verschiedene Subtypen von funktionellen enterischen Neuronen. Diese Plattform bietet eine skalierbare Ressource für Entwicklungsstudien, Krankheitsmodellierung, Wirkstoffforschung und regenerative Anwendungen.

Einleitung

Das enterische Nervensystem (ENS) ist der größte Bestandteil des peripheren Nervensystems. Das ENS enthält mehr als 400 Millionen Neuronen, die sich im Magen-Darm-Trakt befinden und fast alle Funktionen des Darms steuern¹. Das molekulare Verständnis der Entwicklung und Funktion des ENS und seiner Defekte bei enterischen Neuropathien erfordert den Zugang zu einer zuverlässigen und authentischen Quelle für enterische Neuronen. Der Zugang zu menschlichem Primärgewebe ist begrenzt, und Tiermodelle können die wichtigsten Krankheitsphänotypen bei vielen enterischen Neuropathien nicht rekapitulieren. Die Technologie der humanen pluripotenten Stammzell....

Protokoll

1. Vorbereitung der Medien

HINWEIS: Bei den im Protokoll genannten Konzentrationen handelt es sich um Endkonzentrationen der Medienkomponenten. Bereiten Sie alle Medien unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube vor und lagern Sie sie bei 4 °C im Dunkeln. Innerhalb von 2 Wochen verbrauchen.

1. hPSC-Erhaltungsmedium: Mischen Sie das zuführfreie hPSC-Erhaltungsmedium (20 μl/ml) mit dem Basismedium.
2. Medium A: Geben Sie das knochenmorphogenetische Protein 4 (BMP4; 1 ng/ml), SB431542 (10 μM) und CHIR99021 (600 nM) zum Differenzierungsbasismedium.
3. Medium B: Fügen Sie SB431542 (10 μM) und CHI....

Diskussion

Das hier beschriebene Differenzierungsprotokoll bietet eine robuste in vitro-Methode, um enterische Neuronen aus hPSCs innerhalb von 30-40 Tagen (Abbildung 1E) und enterische Gliazellen, die das saure Gliaprotein, GFAP und SOX10 exprimieren, in älteren Kulturen zu erhalten (> Tag 55)13,14,19,22. Diese Neuronen und Gliazellen werden durch schrittweise Diff.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)	Gibco	12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R&D systems	314-BP
Cell culture centrifuge	Eppendorf, model no. 5810R	02262501
Cell detachment solution, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Conical tubes	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6	Life Technologies	A1516401
DMEM/F-12 no glutamine	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R&D systems	233-FB/CF
Fibronectin	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Inverted microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Laminar flow hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series class II, type A2
Laminin	Cultrex	3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Multiwell plates, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (Ca and Mg free)	Life Technologies	10010023
Pipette filler	Eppendorf	Z768715-1EA
Pipette tips	USA scientific	1111-2830
Pipettes	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R&D systems	1614
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Ultra-low attachment plates	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 dihydrochloride	R&D systems	1254