Immunmagnetische Isolierung von in der Gefäßwand ansässigen CD34+ -Stammzellen aus Mäusen

Zusammenfassung

Diese Studie hat eine stabile und effiziente Methode zur Isolierung, Kultivierung und funktionellen Bestimmung von in der Gefäßwand ansässigen CD34⁺ -Stammzellen (CD34⁺ VW-SCs) etabliert. Diese leicht verständliche und zeitsparende Isolationsmethode kann von anderen Forschern genutzt werden, um die möglichen Mechanismen zu untersuchen, die an Herz-Kreislauf-Erkrankungen beteiligt sind.

Zusammenfassung

Residente CD34⁺ -Stamm- und Vorläuferzellen (VW-SCs) werden zunehmend für ihre entscheidende Rolle bei der Regulierung von Gefäßverletzungen und -reparaturen anerkannt. Die Etablierung einer stabilen und effizienten Methode zur Kultivierung funktioneller muriner CD34⁺ VW-SCs ist unerlässlich, um die Mechanismen, die an der Proliferation, Migration und Differenzierung dieser Zellen unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen beteiligt sind, weiter zu untersuchen. Das beschriebene Verfahren kombiniert magnetisches Bead-Screening und Durchflusszytometrie zur Aufreinigung von primär kultivierten residenten CD34⁺ VW-SCs. Die gereinigten Zellen werden dann durch Immunfluoreszenzfärbung und Ca2⁺ -Bildgebung funktionell identifiziert. Kurz gesagt, werden Gefäßzellen aus der Adventitia der murinen Aorta und der Mesenterialarterie durch Anheften von Gewebeblöcken gewonnen, gefolgt von einer Subkultivierung bis zum Erreichen einer Zellzahl von mindestens 1 × 10⁷. Anschließend werden CD34⁺ VW-SCs mittels magnetischer Kügelchensortierung und Durchflusszytometrie aufgereinigt. Die Identifizierung von CD34⁺ VW-SCs beinhaltet die zelluläre Immunfluoreszenzfärbung, während die funktionelle Multipotenz bestimmt wird, indem die Zellen einem spezifischen Kulturmedium zur orientierten Differenzierung ausgesetzt werden. Darüber hinaus wird die funktionelle interne Ca2⁺ -Freisetzung und der externe Ca2⁺ -Eintrag mit einer kommerziell erhältlichen Bildgebungsworkstation in Fura-2/AM-geladenen Zellen bewertet, die ATP, Koffein oder Thapsigargin (TG) ausgesetzt sind. Diese Methode bietet eine stabile und effiziente Technik zur Isolierung, Kultivierung und Identifizierung von in der Gefäßwand ansässigen CD34⁺ -Stammzellen und bietet die Möglichkeit für In-vitro-Studien zu den Regulationsmechanismen von VW-SCs und das Screening von zielgerichteten Medikamenten.

Einleitung

Die Gefäßwand spielt eine zentrale Rolle bei der Gefäßentwicklung, der homöostatischen Regulation und dem Fortschreiten von Gefäßerkrankungen. In den letzten Jahren haben zahlreiche Studien das Vorhandensein verschiedener Stammzelllinien in den Arterien aufgedeckt. Im Jahr 2004 berichtete die Gruppe von Professor Qingbo Xu erstmals über die Existenz von vaskulären Stamm-/Vorläuferzellen in der Peripherie der adulten Gefäßwand, die CD34, Sca-1, c-kit und Flk-1¹ exprimieren. Diese vaskulären Stammzellen weisen ein multidirektionales Differenzierungs- und Proliferationspotenzial auf. Unter normalen Bedingungen bleiben sie relativ ruhig; Wenn sie j....

Protokoll

Diese Studie wurde genehmigt und die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für das Management und die Verwendung von Labortieren in China behandelt. Die Forschung hielt sich strikt an die ethischen Anforderungen von Tierversuchen, mit Genehmigung der Tierethikkommission (Zulassungsnummer: SWMU2020664). Für die vorliegende Studie wurden acht Wochen alte gesunde C57BL/6-Mäuse beiderlei Geschlechts mit einem Gewicht zwischen 18 und 20 g verwendet. Die Tiere wurden im Laboratory Animal Center der Southwest Medical University (SWMU) untergebracht.

1. Gewebeblockkultur von Adventitia aus Aorta und Mesenterialarterien<....

Diskussion

Diese Studie bietet eine schnelle und bequeme Methode zur Gewinnung von funktionellen CD34⁺ VW-SCs aus der Aorta und den Mesenterialarterien von Mäusen. CD34⁺ VW-SCs, die mit dieser Methode erhalten werden, haben proliferative Aktivität und multidirektionale Differenzierungseigenschaften. Triphosphat-Inositol-1,4,5-Trisphosphat-Rezeptoren (IP₃Rs), Ryanodin-Rezeptoren (RyRs) und speicherbetriebene Calciumkanäle vermitteln die Freisetzung und den Eintritt von Ca2⁺ in CD34^.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023