Maus-Modell der linken pulmonalen hilaren Klemme der Lungenischämie-Reperfusionsverletzung

Zusammenfassung

Das Protokoll skizziert eine praktikable, zuverlässige und reproduzierbare Methode des linken pulmonalen hilären Klemmens, die zur Untersuchung von Ischämie-Reperfusionsschäden bei der Lunge in Mausmodellen verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Ischämie-Reperfusionsschäden (IRI) während einer Lungentransplantation sind ein Hauptrisikofaktor für Komplikationen nach der Transplantation, einschließlich primärer Transplantatfunktionsstörungen, akuter und chronischer Abstoßung und Mortalität. Die Bemühungen, die Grundlagen der IRI zu untersuchen, führten zur Entwicklung eines zuverlässigen und reproduzierbaren Mausmodells für das Hilar-Clamping der linken Lunge. Bei diesem Modell handelt es sich um einen chirurgischen Eingriff, der an einer anästhesierten und intubierten Maus durchgeführt wird. Es wird eine linke Thorakotomie durchgeführt, gefolgt von einer sorgfältigen Lungenmobilisation und Dissektion des linken Lungenhilus. Bei der hilären Klemme handelt es sich um eine reversible Nahtligatur des Lungenhilums mit einem Slipknot, der den arteriellen Zufluss, den venösen Abfluss und den Luftstrom durch den linken Hauptstammbronchus stoppt. Die Reperfusion wird durch vorsichtiges Entfernen der Naht eingeleitet. Unser Labor verwendet 30 min Ischämie und 1 h Reperfusion für das Versuchsmodell in den aktuellen Untersuchungen. Diese Zeiträume können jedoch je nach experimenteller Fragestellung modifiziert werden. Unmittelbar vor der Tötung kann arterielles Blutgas aus dem linken Ventrikel nach einer 4-minütigen Periode der rechten hilaren Klemmung entnommen werden, um sicherzustellen, dass die erhaltenen PaO_2-Werte nur der verletzten linken Lunge zugeordnet werden. Wir beschreiben auch eine Methode zur Messung der Zellextravasation mit Durchflusszytometrie, die die intravenöse Injektion eines Fluorochrom-markierten Antikörpers beinhaltet, der für die zu untersuchende(n) Zelle(n) vor der Tötung spezifisch ist. Die linke Lunge kann dann für die Durchflusszytometrie, gefroren oder fixiert, die in Paraffin eingebettete Immunhistochemie und die quantitative Polymerase-Kettenreaktion entnommen werden. Diese hilare Clamp-Technik ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die der IRI zugrunde liegen. Repräsentative Ergebnisse zeigen eine verminderte Sauerstoffversorgung der linken Lunge und histologische Hinweise auf eine Lungenschädigung nach hilärem Klemmen. Diese Technik kann von Personal mit und ohne mikrochirurgische Erfahrung leicht erlernt und reproduziert werden, was zu zuverlässigen und konsistenten Ergebnissen führt und als weit verbreitetes Modell für die Untersuchung der Lungen-IRI dient.

Einleitung

Die IRI während einer Organtransplantation ist ein Hauptrisikofaktor für eine primäre Transplantatdysfunktion und spätere Episoden der Transplantatabstoßung ^1,2. Während der Transplantation ist die warme Ischämiezeit definiert als die Zeitspanne von der Kreuzklemmung der Spenderaorta bis zum Beginn der kalten Perfusion und von der Organentnahme aus dem Eis bis zur Organimplantation. Die Kältelagerzeit ist definiert als der Zeitraum vom Beginn der Kaltperfusion bis zur Entnahme des Organs aus dem Eis³. Die warme Ischämie ist für die spätere Organfunktion schädlicher als die kalte Ischämi....

Protokoll

Alle Studien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Washington University School of Medicine genehmigt. Die Tiere erhielten eine humane Pflege in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, 8^. Auflage²¹ , der von der National Academy of Sciences erstellt und von den National Institutes of Health veröffentlicht wurde, und den von der National Society for Medical Research formulierten Grundsätzen für die Pflege von Labortieren.

1. Anästhesie und Intubation

1. Wählen Sie eine Maus, die mindestens 25 g wiegt. Dies erleichtert d....

Diskussion

Wir beschreiben eine hilare Clamp-Technik, bei der ein Slipknot am linken Hilum angelegt wird, der die Lungenarterie und die Venen und den Bronchus verschließt, um eine warme Ischämie mit anschließender Reperfusion zu induzieren. Nach dem hilären Klemmen kann die linke Lunge für eine Vielzahl von experimentellen Techniken wie Histologie, Durchflusszytometrie, Massen- oder Einzelzellsequenzierung und quantitative Polymerase-Kettenreaktion entnommen werden. Darüber hinaus können Blut und Milz verwendet werden, um sy.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection