Maus-Modell der linken pulmonalen hilaren Klemme der Lungenischämie-Reperfusionsverletzung

Zusammenfassung

Das Protokoll skizziert eine praktikable, zuverlässige und reproduzierbare Methode des linken pulmonalen hilären Klemmens, die zur Untersuchung von Ischämie-Reperfusionsschäden bei der Lunge in Mausmodellen verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Ischämie-Reperfusionsschäden (IRI) während einer Lungentransplantation sind ein Hauptrisikofaktor für Komplikationen nach der Transplantation, einschließlich primärer Transplantatfunktionsstörungen, akuter und chronischer Abstoßung und Mortalität. Die Bemühungen, die Grundlagen der IRI zu untersuchen, führten zur Entwicklung eines zuverlässigen und reproduzierbaren Mausmodells für das Hilar-Clamping der linken Lunge. Bei diesem Modell handelt es sich um einen chirurgischen Eingriff, der an einer anästhesierten und intubierten Maus durchgeführt wird. Es wird eine linke Thorakotomie durchgeführt, gefolgt von einer sorgfältigen Lungenmobilisation und Dissektion des linken Lungenhilus. Bei der hilären Klemme handelt es sich um eine reversible Nahtligatur des Lungenhilums mit einem Slipknot, der den arteriellen Zufluss, den venösen Abfluss und den Luftstrom durch den linken Hauptstammbronchus stoppt. Die Reperfusion wird durch vorsichtiges Entfernen der Naht eingeleitet. Unser Labor verwendet 30 min Ischämie und 1 h Reperfusion für das Versuchsmodell in den aktuellen Untersuchungen. Diese Zeiträume können jedoch je nach experimenteller Fragestellung modifiziert werden. Unmittelbar vor der Tötung kann arterielles Blutgas aus dem linken Ventrikel nach einer 4-minütigen Periode der rechten hilaren Klemmung entnommen werden, um sicherzustellen, dass die erhaltenen PaO_2-Werte nur der verletzten linken Lunge zugeordnet werden. Wir beschreiben auch eine Methode zur Messung der Zellextravasation mit Durchflusszytometrie, die die intravenöse Injektion eines Fluorochrom-markierten Antikörpers beinhaltet, der für die zu untersuchende(n) Zelle(n) vor der Tötung spezifisch ist. Die linke Lunge kann dann für die Durchflusszytometrie, gefroren oder fixiert, die in Paraffin eingebettete Immunhistochemie und die quantitative Polymerase-Kettenreaktion entnommen werden. Diese hilare Clamp-Technik ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die der IRI zugrunde liegen. Repräsentative Ergebnisse zeigen eine verminderte Sauerstoffversorgung der linken Lunge und histologische Hinweise auf eine Lungenschädigung nach hilärem Klemmen. Diese Technik kann von Personal mit und ohne mikrochirurgische Erfahrung leicht erlernt und reproduziert werden, was zu zuverlässigen und konsistenten Ergebnissen führt und als weit verbreitetes Modell für die Untersuchung der Lungen-IRI dient.

Einleitung

Die IRI während einer Organtransplantation ist ein Hauptrisikofaktor für eine primäre Transplantatdysfunktion und spätere Episoden der Transplantatabstoßung ^1,2. Während der Transplantation ist die warme Ischämiezeit definiert als die Zeitspanne von der Kreuzklemmung der Spenderaorta bis zum Beginn der kalten Perfusion und von der Organentnahme aus dem Eis bis zur Organimplantation. Die Kältelagerzeit ist definiert als der Zeitraum vom Beginn der Kaltperfusion bis zur Entnahme des Organs aus dem Eis³. Die warme Ischämie ist für die spätere Organfunktion schädlicher als die kalte Ischämie ^4,5,6, und ihre zugrunde liegenden Mechanismen rechtfertigen weitere Studien in präklinischen Modellen. Darüber hinaus ist eine Organtransplantation aus einer Spende nach Herztod (DCD) mit längeren warmen ischämischen Zeiten verbunden als eine herkömmliche Spende nach Hirntod (DBD)⁷. Während der Einsatz von DCD-Spendern den Spenderpool erweitern und die Lungenauslastung erhöhen kann, sind weitere präklinische Studien erforderlich, um die Auswirkungen der warmen Ischämie auf die Lungenfunktion nach der Transplantation zu bewerten. Im Folgenden beschreiben wir ein Modell der warmen IRI bei Mäusen über die linke pulmonale Hilarklemme.

Mehrere Tiermodelle für die hiläre Lungenklemmung wurden in den letzten Jahren entwickelt und angepasst und können die Verwendung einer atraumatischen mikrovaskulären Klemme 8,9,10,11,12,13, eines Rumel-Tourniquets^14,15 oder einer Nahtligatur¹⁶ umfassen wie die hilare Klemme. Die Krux an der hilären Klemme ist, dass sie reversibel sein muss und die hilären Strukturen nur minimal oder gar nicht schädigt, damit eine Reperfusion erreicht werden kann. Hier beschreiben wir unsere hilare Clamp-Technik bei Mäusen, bei der es sich um eine reversible Nahtligatur des linken Lungenhilums mit einem Slipknot handelt. Bei dieser Methode werden der pulmonalarterielle Zufluss, der venöse Abfluss und der Luftstrom in und aus dem Hauptstammbronchus verschlossen. Der Hauptvorteil eines Slipknot über einer Gefäßklemme, einem Clip oder einem Tourniquet besteht darin, dass der Brustkorb bei längerer Ischämie geschlossen werden kann, wodurch unmerkliche Flüssigkeit und Wärmeverluste in der Maus minimiert werden. Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, um zuverlässige arterielle Blutgasmessungen (ABG) zu erhalten und die Zellextravasation nach hilärem Clamping zu messen.

Diese hilare Clamp-Technik nimmt einen wichtigen Platz in der breiteren Erforschung der Lungentransplantation ein. Im Vergleich zu Kleintiermodellen der orthotopen Lungentransplantation kann die Hilar-Clamp-Technik die Auswirkungen der IRI ohne Zusatz eines chirurgischen Anastomosentraumas oder einer Allogenität isolieren¹⁷. Darüber hinaus kann die Hilar-Clamp-Technik einfacher und schneller gemeistert werden als die Lungentransplantation bei Mäusen. Tatsächlich wurden in den letzten zehn Jahren mit hilären Clamp-Techniken mehrere wichtige Mechanismen in der Pathogenese der IRI identifiziert, wie z. B. TLR4, NADPH-Oxidase und Adenosin-A2A-Rezeptor 14,18,19,20. Im folgenden Protokoll stellen wir eine zuverlässige, lehrbare und reproduzierbare Methode des hilären Klemmens als Werkzeug zur Untersuchung der Lungen-IRI vor.

Protokoll

Alle Studien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Washington University School of Medicine genehmigt. Die Tiere erhielten eine humane Pflege in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, 8^. Auflage²¹ , der von der National Academy of Sciences erstellt und von den National Institutes of Health veröffentlicht wurde, und den von der National Society for Medical Research formulierten Grundsätzen für die Pflege von Labortieren.

1. Anästhesie und Intubation

1. Wählen Sie eine Maus, die mindestens 25 g wiegt. Dies erleichtert die Intubation aufgrund der größeren Öffnung zwischen den Stimmbändern.
2. Injizieren Sie der Maus intraperitoneal eine Mischung aus Ketamin (Dosis 100 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (Dosis 10 mg/kg Körpergewicht). Diese Mischung sollte in eine 1/2 cc Spritze mit einer 1/2 Zoll 29G Nadel geladen werden. Warten Sie etwa 5 Minuten, bis Ketamin wirkt - die Maus sollte keine spontanen Bewegungen zeigen und reagiert nicht auf ein Zehenkneifen, was eine ausreichende Anästhesie bestätigt.
3. Injizieren Sie Buprenorphin (Dosis 0,05 mg/kg Körpergewicht) subkutan vor der Operation zur zusätzlichen Schmerzkontrolle.
4. Tragen Sie eine nicht medikamentöse Augensalbe auf beide Augen auf, um eine Austrocknung der Hornhaut während der Operation zu vermeiden.
5. Rasieren Sie die Maus mit einem Haarschneider über die linke Brust und den Rücken (siehe Abbildung 1A) und verlängern Sie sie auf den Bauch, wenn eine Laparotomie geplant ist (siehe Schritt 5.3).
6. Sobald die Maus anästhesiert ist, führen Sie die Intubation mit einer bevorzugten Intubationsanordnung durch und den Rest des Eingriffs unter einem Mikroskop über einer erwärmten Matte bei ~37 °C (um die Normothermie in der Maus zu erhalten).
7. Nachdem Sie eine ausreichende Sicht auf die Stimmbänder erhalten haben, führen Sie einen selbstgemachten Einführapparat (siehe ergänzende Abbildung 1) mit einer Kurve am Ende in einen 1-Zoll-20G-Angiokatheter ein, der als Endotrachealtubus (ETT) verwendet wird. Führen Sie die Spitze des Einführers und dann das ETT zwischen und an den Stimmbändern vorbei.
   HINWEIS: Es ist wichtig, sich vorzustellen, wie der ETT durch die Stimmbänder geht, um eine falsche Intubation in die Speiseröhre zu vermeiden. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Stimmbänder während der Intubation nicht verletzt werden (d. h. die Anzahl der Intubationsversuche sollte auf 5 begrenzt werden und die ETT sollte nicht vorgezogen werden, wenn der Widerstand erreicht wird).
8. Sobald das ETT eingesetzt ist, entfernen Sie die Einführhilfe und schließen Sie das ETT an ein Beatmungsgerät für Kleintiere an. Achten Sie auf eine symmetrische Brustanhebung, um die korrekte endotracheale Intubation zu bestätigen. Die Einstellungen des Beatmungsgeräts sollten 100-105 Atemzüge pro Minute und einen Anteil an eingeatmetem Sauerstoff von 100 % betragen. Das Atemzugvolumen beträgt 0,35 mL und der positive endexspiratorische Druck 1 cm H₂O.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich der Brustkorb und nicht der Bauch hebt, da eine versehentliche Intubation der Speiseröhre zum Tod führt, wenn sie nicht sofort korrigiert wird.
9. Sobald die Bestätigung der Position ist, befestigen Sie das ETT mit einem 5 cm breiten Streifen 1 Zoll Seidenband um die Mausnase und achten Sie auf einen ausreichenden Kontakt mit dem ETT und der Nase, damit das ETT nicht aus dem Mund rutscht (siehe Abbildung 1B-C).
10. Um eine angemessene Anästhesie während der gesamten Operation aufrechtzuerhalten, verabreichen Sie 1 % bis 1,5 % Isofluran im Einklang mit dem Sauerstofffluss.

2. Thorakotomie

1. Positionieren Sie die Maus in der rechten seitlichen Dekubitusposition, wobei beide Vorderpfoten an der oberen linken Ecke, die rechte Hinterpfote an der unteren linken Ecke und die linke Hinterpfote an der unteren rechten Ecke befestigt sind (siehe Abbildung 2G zum Kleben).
2. Desinfizieren Sie mit der Haut über der linken Brust mit mindestens 3 abwechselnden Runden Povidon-Jod, gefolgt von einer Anwendung mit 70% Alkohol.
3. Führen Sie einen Schnitt über den 4^. Interkostalraum von der vorderen Achsellinie bis zur hinteren Achsellinie durch und öffnen Sie die darüber liegende Haut mit einer Schere (siehe Abbildung 2A). Der 4^. Interkostalraum befindet sich ca. 1 cm unterhalb der Achselhöhle in der Mittelachsellinie.
4. Um den Blutverlust zu minimieren, koagulieren Sie die sichtbaren Blutgefäße in den Unterhaut- und Muskelschichten mit einem tragbaren Kauterstift.
5. Teilen Sie die Muskeln latissimus dorsi und serratus anterior mit einer Schere scharf entlang der Länge des Hautschnitts (siehe Abbildung 2B).
6. Heben Sie die 4^. Rippe vorsichtig mit einer fein gebogenen Pinzette an (achten Sie darauf, die darunter liegende Lunge nicht zu verletzen) und schneiden Sie mit einer feinen Schere knapp über der 5^{. Rippe} punktgenau, um in den 4^. Interkostalraum einzudringen (siehe Abbildung 2C). Führen Sie die Thorakotomie oberhalb der 5^. Rippe und nicht unterhalb der 4^{. Rippe} durch, um eine Verletzung des interkostalen neurovaskulären Bündels zu vermeiden.
7. Sobald der negative Druck der Pleurahöhle verloren geht und sich die Lunge von der Brustwand zurückzieht, verlängern Sie die Thorakotomie anterior und posterior im 4^. Interkostalraum direkt über der 5^. Rippe (siehe Abbildung 2D-E). Die gesamte Länge des Schnitts sollte lang genug sein, um die gesamte Lunge freizulegen, normalerweise ~1 cm.
   HINWEIS: Blutungen der inneren Brustarterie können auftreten, wenn die Thorakotomie zu weit nach vorne ausgedehnt wird - wenn sie auftritt, sollte diese kauterisiert werden, um einen übermäßigen Blutverlust zu vermeiden.
8. Bringen Sie zwei Rippenaufroller an, um den Rippenraum zu spreizen, so dass ein Arbeitsfenster von mindestens 1 cm² für eine angemessene Visualisierung vorhanden ist (siehe Abbildung 2F-G).

3. Anwendung der hilaren Klemme

1. Mobilisieren Sie die linke Lunge mit zweizackigen Applikatoren mit Wattespitze, indem Sie sie cephalad anheben und dann das durchscheinende untere Lungenband stumpf teilen (siehe Abbildung 3A-B).
   HINWEIS: Wenn dies ohne Lungenriss schwierig durchzuführen ist, kann das untere Lungenband auch mit einer feinen Schere scharf geteilt werden.
2. Reflektieren Sie die Lunge nach vorne, so dass der hintere linke Lungenhilum sichtbar gemacht werden kann. Schneiden Sie ein Stück 6-0 Seidenkrawatte auf ~10 cm ab und platzieren Sie den Mittelpunkt dieser Krawatte hinter dem Hilum (siehe Abbildung 3C).
3. Drehen Sie dann die linke Lunge nach hinten, um sich über die Krawatte zu legen, und ziehen Sie beide Enden der Krawatte nach vorne (siehe Abbildung 3D).
4. Mit den beiden freien Enden (A und B) der Krawatte binden Sie einen reversiblen Schlupfknoten mit Pinzette und einer gebogenen Moskitoklemme. Siehe detaillierte Beschreibung in den Schritten 3.4.1 und 3.4.2. Die warme ischämische Zeit beginnt mit dem Binden des Slipknotens. Die linke Lunge sollte sich nicht mehr bei jedem Atemzug des Beatmungsgeräts aufblähen, sobald der Knoten gebunden ist. Es sollte blassweiß werden, was eine Beendigung der Durchblutung bedeutet.
   HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass der Knoten in der Mitte des Hilums sitzt, um zu vermeiden, dass versehentlich der linke Vorhof mittig und das Lungenparenchym seitlich eingeklemmt wird (siehe Abbildung 3F).
   1. Halten Sie mit der Klemme in der dominanten Hand und der Pinzette in der nicht-dominanten Hand das Ende von A mit einer Pinzette fest und schlingen Sie den Mittelpunkt von A einmal um die geschlossene Klemme (siehe Abbildung 3E).
   2. Fassen Sie mit der Klemme den Mittelpunkt von B und ziehen Sie mit beiden Händen, um den Knoten festzuziehen. Lassen Sie das Ende von B nicht durch den Knoten ziehen, da dies den Knoten irreversibel machen würde. Nach dem Binden des Knotens sollte bei B eine Schlaufe vom Knoten ausgehen, während A gerade sein sollte (siehe Abbildung 3F). Der Knoten kann durch Ziehen am Ende von B gelöst werden.
5. Bestätigen Sie einen adäquaten Verschluss des Bronchus, indem Sie den Abflussschlauch vom ETT zum Beatmungsgerät manuell verschließen, was dazu führen sollte, dass sich die linke Lunge nicht aufbläht (siehe Abbildung 3G). Bei einem Bronchialverschluss wird von einem Gefäßverschluss ausgegangen, da die Kollabierbarkeit der Lungenarterie und der Lungenvenen im Vergleich zum Knorpelbronchus erhöht ist.
6. Nach dem Anlegen der Hilarklemme schließen Sie den Hautschnitt mit einem einfachen unterbrochenen Stich mit einer 6-0-Nylonnaht, um unmerkliche Flüssigkeitsverluste während der Zeit der warmen Ischämie zu minimieren.

4. Lösen der hilaren Klemme

1. Nach der gewünschten Zeit der warmen Ischämie lösen Sie den Slipknot, indem Sie vorsichtig am kurzen freien Ende des Seidenbandes ziehen (B aus Abbildung 3F und Schritt 3.4). Starten Sie die Reperfusionszeit nach dem Lösen des Slipknotens.
   HINWEIS: Nach dem Lösen der Bindung kann die Lungenventilation durch einen erneuten manuellen Verschluss des Abflusses des ETT bestätigt werden, was nun zu einer Ausdehnung der linken Lunge führen sollte. Auch hier wird die Durchblutung mit der Blähung der Lunge impliziert, kann aber auch durch ein Aufblähen der Lunge bestätigt werden (siehe Abbildung 4A).
2. Während der Reperfusionsphase schließen Sie die Brust in drei Schichten, um unmerkliche Verluste zu minimieren. Zuerst schließen Sie den 4^. Rippenraum mit einem einzigen Stich mit 6-0 Nylonnaht, mit einem Biss knapp über der 4^. Rippe und einem Biss knapp über der 6^. Rippe (siehe Abbildung 4B-C). Binden Sie diese bei maximaler Lungenaufblähung, um das Risiko eines iatrogenen Pneumothorax zu minimieren (siehe Abbildung 4D-E).
3. Als nächstes verschließen Sie die Muskelschicht mit einem einfachen Laufstich mit 6-0 Nylonnaht.
4. Zum Schluss schließen Sie den Hautschnitt mit einem einfachen unterbrochenen Stich mit 6-0 Nylonnaht (siehe Abbildung 4F). Vermeiden Sie Laufstiche auf der Haut, da die Gefahr besteht, dass wache Tiere an ihrem Schnitt picken und zu einer vollständigen Wunddehiszenz führen.
5. Von diesem Zeitpunkt an kann die Lunge am Ende der gewünschten Reperfusionszeit direkt entnommen werden. Wenn eine ABG-Auswertung gewünscht wird, lesen Sie Schritt 5. Wenn vor der Tötung eine zusätzliche intravenöse Injektion gewünscht wird, siehe Schritt 6. Dies ist eine unheilbare Operation.
6. Wenn die Reperfusionszeit länger als ein paar Stunden sein soll, schalten Sie das Isofluran aus, damit die Maus aus der Narkose erwachen und extubieren kann. Zu den Kriterien für die Extubation gehören Zuckungen mit Pfotenkneifen sowie spontane Atmung und Bewegung. Das Aufwachen einer Maus aus der Ketamin- und Isofluran-Anästhesie dauert in der Regel 30-45 Minuten. Dies ist eine Überlebensoperation.
   1. Für die Überlebensoperation injizieren Sie 1 ml warme Kochsalzlösung subkutan, um Flüssigkeitsverluste durch die Operation auszugleichen. Injizieren Sie Buprenorphin (Dosis 0,05 - 0,1 mg/kg Körpergewicht) subkutan vor der Operation zur Schmerzkontrolle. Wiederholen Sie die Anästhesie alle 4-6 Stunden für mindestens 3 Tage nach der Operation. Erwägen Sie eine Bupivacain-Blockade entlang des Schnitts zur zusätzlichen Schmerzkontrolle.

5. ABG-Evaluierung

HINWEIS: Wenn eine ABG-Messung gewünscht wird, wird diese am besten durch arterielle Blutaspiration aus dem linken Ventrikel erreicht. Um sicherzustellen, dass das ABG nur die Funktion der linken Lunge widerspiegelt, sollte dieses arterielle Blut nach etwa 4 Minuten nach dem Einklemmen des rechten Hilums^{gewonnen werden 22,23}, während dieser Zeit wird nur die linke Lunge mit Sauerstoff versorgt und beatmet.

1. Wenn die Maus nach einer hilären Klemmung aus der Narkose geweckt wurde, betäuben und intubieren Sie die Maus gemäß Schritt 1.
2. Etwa 15-20 Minuten vor Ablauf der gewünschten Reperfusionszeit die Maus in Rückenlage legen und alle vier Gliedmaßen mit Klebeband sichern.
   HINWEIS: Für die folgenden Schritte, die vor dem Ende der Reperfusion durchgeführt werden müssen, sollte ausreichend Zeit eingeplant werden. Der genaue Zeitpunkt für die Öffnung von Bauch und Brust hängt vom Chirurgen und seiner Erfahrung ab.
3. Führen Sie eine Mittellinienlaparotomie vom Schambein bis zum Xiphoid durch, indem Sie mit einer Schere die Haut und anschließend die Bauchdecke entlang der Linea alba einschneiden (siehe Abbildung 5A-B).
4. Am Xiphoid wird die Laparotomie links und rechts bis zur vorderen Achsellinie verlängert, wobei man der Krümmung der untersten Rippe folgt (siehe Abbildung 5C).
5. Schneiden Sie vom Bauch aus das vordere Zwerchfell in der Mittellinie ein, um in den Brustkorb einzudringen, und achten Sie darauf, nicht zu tief zu gehen, um eine Verletzung des Herzens zu vermeiden (siehe Abbildung 5D-E). Verlängern Sie dann den vorderen Zwerchfellschnitt nach links und rechts bis zur vorderen Achsellinie entlang der untersten Rippe (siehe weiße gestrichelte Linie in Abbildung 5D).
6. Teilen Sie die beidseitigen Rippen entlang der vorderen Achsellinie, die sich nach oben zur Achselhöhle erstrecken, um eine Clamshell-Thorakotomie zu erhalten. Reflektieren Sie dann die vordere Brustwand (Brustbein und bilaterale vordere Rippen), was eine vollständige Freilegung des Herzens und der beidseitigen Lunge ermöglicht (siehe weiße gestrichelte Linien in Abbildung 5F).
7. Bringen Sie eine Klemme an der vorderen Brustwand an, die nach cephalad geklappt wird, um die Retraktion zu erleichtern. Ziehen Sie das Zwerchfell mit einer gebogenen Mückenklemme in der Mittellinie nach unten zurück, um die Sichtbarkeit des Brustkorbs zu verbessern (siehe Abbildung 5F).
8. Um die rechte Lunge (die 4 Lappen hat) vollständig zu mobilisieren, führen Sie den akzessorischen Lappen, der über die Mittellinie in die linke Brust hinausragt, wieder in die rechte Brust zurück (siehe Abbildung 5G-H). Es gibt ein dünnes Band, das diesen Lappen an der linken Brust befestigt - teilen Sie es entweder stumpf mit Applikatoren mit Wattespitze oder scharf mit einer Schere.
   HINWEIS: Dieser Zubehörlappen kreuzt die Mittellinie hinter der unteren Hohlvene (IVC), daher muss darauf geachtet werden, dass die IVC bei diesem Manöver nicht verletzt wird.
9. Sobald alle Lappen wieder in die rechte Brust zurückgeführt sind, reflektieren Sie die gesamte rechte Lunge nach vorne und platzieren Sie eine weitere 6-0 Seidenkrawatte (auf ~10 cm geschnitten) hinter dem rechten Hilum. Setze dann die rechte Lunge wieder in die Brust über der Krawatte ein.
10. Binden Sie einen weiteren Slipknot um den rechten Hilum mit der gleichen Technik wie in Schritt 3.4 beschrieben, wobei Sie darauf achten, alle vier Lappen der rechten Lunge zu umschließen. Dieser rechtshiläre Klemmschritt sollte so geplant werden, dass er etwa 4 Minuten vor dem Ende der Reperfusion liegt.
11. Beschichten Sie eine 1/2 Zoll große 31G-Nadel auf einer 1-cm³-Tuberkulinspritze mit etwa 200 μl Heparin 1000 Einheit/ml. Ziehen Sie dazu das Heparinvolumen nach oben und ziehen Sie den Kolben 3-4 Mal wiederholt hin und her, damit das Heparin die gesamte Innenseite der Spritze beschichten kann. Dies geschieht, um das Risiko einer Gerinnung von aspiriertem Blut während des Transports von der Operationsstation zur ABG-Maschine zu minimieren.
12. Nach 4 Minuten des Klemmens des rechten Hilus aspirieren Sie arterielles Blut aus dem linken Ventrikel in die mit Heparin beschichtete Spritze (siehe Abbildung 5I). Achten Sie darauf, dass das Ventrikelseptum nicht durchstochen wird und versehentlich venöses rechtsventrikuläres Blut aspiriert wird. Es gibt einen deutlichen Farbunterschied zwischen dem dunkleren rechten Ventrikel und dem helleren linken Ventrikel (siehe Abbildung 5I Einschub). Winkeln Sie die Nadel in Richtung des linken Halses an. Möglicherweise sind mehrere Punktionen erforderlich, um genügend Blut für einen ABG (~150 μl) zu erhalten.
    HINWEIS: Während der 4 Minuten der rechten hilaren Klemmung kann die Maus beginnen, eine agonale Atmung zu zeigen, die den bevorstehenden Tod ankündigt. In diesem Fall sollte arterielles Blut vor einem Herzstillstand zügig abgesaugt werden. Es ist nicht möglich, Blut aus einem nicht schlagenden Herzen zu aspirieren.
13. Lassen Sie das arterielle Blut auf einem ABG-Gerät laufen, um unter anderem die Sauerstoffsättigung, den Sauerstoffpartialdruck und den Kohlendioxidpartialdruck zu erhalten. Euthanasieren Sie die Maus nach ABG-Entnahme und/oder Antikörperbehandlung (siehe Schritt 6).

6. Intravenöse Antikörperinjektion zur Messung der Zellextravasation

HINWEIS: Diese Technik kann verwendet werden, um die Zellextravasation durch intravenöse Injektion von Fluorochrom-markierten Antikörpern in die IVC vor der Tötung und anschließender durchflusszytometrischer Analyse zu bestimmen, wie zuvor veröffentlicht¹⁸. Kurz gesagt, intravaskuläre Neutrophile können von interstitiellen Neutrophilen unter Verwendung von neutrophilenspezifischen Anti-Ly6G-Antikörpern unterschieden werden. Fluorescein-Isothiocyanat-markiertes (FITC-markiertes) Anti-Ly6G (Klon 1A8) wird 5 Minuten vor der Tötung intravenös injiziert, wodurch die zirkulierenden intravaskulären Neutrophilen markiert werden. Die Konzentration des verwendeten FITC-Ly6G-Antikörpers beträgt 100 ng verdünnt in 200 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Nach der Vorbereitung einer Einzelzellsuspension aus der linken Lunge für die Durchflusszytometrie werden alle Neutrophilen mit Allophycocyanin-markiertem (APC-markiertem) Anti-Ly6G (Klon 1A8) markiert. Somit sind APC-Ly6G⁺FITC-Ly6G⁺ Neutrophile intravaskulär, während APC-Ly6G⁺FITC-Ly6G^- extravaskulär oder interstitiell sind. Diese Technik kann beispielsweise an Monozyten mit Anti-Ly6C-Antikörpern, B-Zellen mit Anti-CD19-Antikörpern angepasst werden.

1. Laden Sie den gewünschten Antikörper in eine 3/10-cm³-Spritze mit einer 5/16-Zoll-31G-Nadel, wobei darauf zu achten ist, dass die Luftblasen in der Spritze minimiert werden. Verwenden Sie dies für die intravenöse Injektion in die IVC in Schritt 6.5.
2. Führen Sie die Laparotomie gemäß den Schritten 5.3-5.4 durch.
3. Nach der Laparotomie führen Sie die rechte mediale viszerale Rotation stumpf mit zwei spitzen Applikatoren mit Wattespitze durch. Bei einer Maus geschieht dies, indem der gesamte Darm links vom Bauch ausgeweidet wird, was eine klare Sicht auf die IVC ermöglicht (siehe Abbildung 6A).
4. Entfernen Sie das Fett, das über der IVC liegt, stumpf mit Applikatoren mit Wattespitze.
5. Injizieren Sie die Antikörperlösung mittels Venenpunktion in die IVC (siehe Abbildung 6B). Nach der Extraktion der Nadel üben Sie sofort mit einem Wattestäbchen leichten Druck auf die Stelle der Venenpunktion aus, bis sie hämostatisch ist (in der Regel ca. 2-3 Minuten).
6. Bringen Sie den ausgeweideten Darm über das Wattestäbchen in den Bauch zurück, um weiterhin Druck auf die IVC auszuüben (siehe Abbildung 6C).
7. Führen Sie eine Clamshell-Thorakotomie gemäß den Schritten 5.5-5.7 durch, um die linke Lunge zu entnehmen. Lassen Sie die Antikörper mindestens 5 Minuten Zeit haben, um systemisch zu zirkulieren, bevor sie geschlachtet und geerntet werden. Euthanasieren Sie die Maus nach der ABG-Entnahme und/oder Antikörperbehandlung.

7. Histologische (H&E) Färbung

1. Nach der Formalinfixierung und Paraffineinbettung der linken Lunge und dem Schnitt auf eine Dicke von 5 μm wird der Objektträger in Xylol entparaffinisiert (zwei 10-minütige Wäschen).
2. Dehydrieren in sequentiellen Ethanol-Wäschen: 2x 5 min Wäschen mit 100%, 1x 2 min Wäsche mit 95% und 1x 2 min Wäsche mit 70% Ethanol. Dann in entionisiertem Wasser abspülen.
3. Färben Sie den Objektträger 2-4 Minuten lang mit Hämatoxylin und waschen Sie ihn dann 5 Minuten lang mit entionisiertem Wasser oder bis er klar ist. Die genaue Dauer der Hämatoxylin-Färbung muss auf das Gewebe und die gewünschte Intensität der Kernfärbung abgestimmt werden.
4. 30 s lang in der definierenden Lösung waschen, um die Flecken zu unterscheiden, dann 2 Minuten lang in Wasser waschen. In blauer farbbildender Lösung 30 s waschen, dann 2 min in Wasser waschen.
5. Dehydrieren Sie weiter, indem Sie 15x in 95% Ethanol eintauchen. 1 Min. in Eosin einfärben.
6. Dehydrieren Sie mit 2 min Ethanol-Waschungen (2x), gefolgt von 2 min Xylol-Waschungen (2x). Montagemedium und Deckglas aufbringen.

Ergebnisse

Nach linker hilärer Klemmung beträgt der Partialdruck der Oxygenierung im arteriellen Blut (PaO₂), der der linken Lunge zugeschrieben wird, ~100 mmHg, signifikant niedriger im Vergleich zu den ~500 mmHg nach Scheinthorakotomie (Abbildung 7A, n=6-7). Bemerkenswert ist, dass Schein-Thorakotomien bei B6-Mäusen durchgeführt wurden, wobei die ABG-Messung nach 4 Minuten nach rechtsem Hilar-Clamping durchgeführt wurde, was den Werten entspricht, die nur der linken Lunge zugeschriebe...

Diskussion

Wir beschreiben eine hilare Clamp-Technik, bei der ein Slipknot am linken Hilum angelegt wird, der die Lungenarterie und die Venen und den Bronchus verschließt, um eine warme Ischämie mit anschließender Reperfusion zu induzieren. Nach dem hilären Klemmen kann die linke Lunge für eine Vielzahl von experimentellen Techniken wie Histologie, Durchflusszytometrie, Massen- oder Einzelzellsequenzierung und quantitative Polymerase-Kettenreaktion entnommen werden. Darüber hinaus können Blut und Milz verwendet werden, um sy...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection