Messung der bakteriellen Besiedlung von Arabidopsis thaliana-Wurzeln im hydroponischen Zustand

Zusammenfassung

Die Besiedlung mit pflanzenwachstumsfördernden Rhizobakterien (PGPR) in der Rhizosphäre ist essentiell für ihre wachstumsfördernde Wirkung. Es ist notwendig, die Methode zum Nachweis der bakteriellen Rhizosphärenbesiedlung zu standardisieren. Hier beschreiben wir eine reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der bakteriellen Besiedlung auf der Wurzeloberfläche.

Zusammenfassung

Die Messung der bakteriellen Besiedlung der Arabidopsis thaliana-Wurzel ist eines der häufigsten Experimente in Studien zur Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben. Um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, ist eine standardisierte Methode zur Messung der bakteriellen Besiedlung in der Rhizosphäre notwendig. Wir kultivierten zunächst steriles A.thaliana unter hydroponischen Bedingungen und inokulierten dann die Bakterienzellen in der Rhizosphäre mit einer Endkonzentration von OD₆₀₀ von 0,01. 2 Tage nach der Inokulation wurde das Wurzelgewebe entnommen und dreimal in sterilem Wasser gewaschen, um die unbesiedelten Bakterienzellen zu entfernen. Anschließend wurden die Wurzeln gewogen und die an der Wurzel besiedelten Bakterienzellen durch einen Wirbel gesammelt. Die Zellsuspension wurde in einem Gradienten mit einem phosphatgepufferten Kochsalzpuffer (PBS) verdünnt und anschließend auf ein Luria-Bertani (LB)-Agarmedium aufgebracht. Die Platten wurden 10 h lang bei 37 °C inkubiert, und dann wurden die einzelnen Kolonien auf LB-Platten gezählt und normalisiert, um die Bakterienzellen anzuzeigen, die auf den Wurzeln besiedelt waren. Diese Methode wird verwendet, um bakterielle Besiedlung in der Rhizosphäre unter Monointeraktionsbedingungen mit guter Reproduzierbarkeit nachzuweisen.

Einleitung

Es gibt quantitative und qualitative Methoden, um die Rhizosphärenbesiedlung durch einen einzelnen Bakterienstamm nachzuweisen. Für die qualitative Methode sollte ein Stamm verwendet werden, der konstitutiv Fluoreszenz exprimiert, und die Fluoreszenzverteilung und -intensität sollte unter Fluoreszenzmikroskopie oder konfokalen Laserinstrumenten untersucht werden ^1,2. Diese Strategien können die bakterielle Besiedlung in situ³ gut widerspiegeln, aber sie sind bei der Quantifizierung nicht so genau wie herkömmliche Plattenzählmethoden. Aufgrund der Einschränkung, nur partielle Wu....

Protokoll

1. Steriler hydroponischer Anbau von A. thaliana

1. Bereiten Sie A . thaliana-Sämlinge vor.
   1. Bereiten Sie Kulturmedium für A. thaliana vor, das aus 1/2 MS-Medium (Murashige und Skoog) mit 2 % (wt/vol) Saccharose und 0,9 % (wt/vol) Agar besteht.
   2. Gießen Sie das vorbereitete Sterilisationsmedium vor dem Erstarren in sterile quadratische Petrischalen (13 cm x 13 cm). Vermeiden Sie das Austrocknen an der Luft, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
   3. Tauchen Sie die Samen von A. thaliana für mehr als 12 Stunden in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 1 mL steri....

Diskussion

Um eine gute Reproduzierbarkeit zu erreichen, gibt es vier kritische Schritte für den Besiedlungsnachweis dieses Protokolls. Zunächst muss sichergestellt werden, dass die Anzahl der geimpften Bakterienzellen in jedem Experiment genau gleich ist. Zweitens ist es auch notwendig, die Reinigungsintensität der unbesiedelten Bakterien mit sterilem Wasser zu kontrollieren. Drittens muss jeder Probenverdünnungsprozess vor der Durchführung vortexiert werden, damit sich die Probe in einem vollständigen Mischzustand befindet,.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E