Verwendung eines In-vitro-Gewebeperfusionssystems zum Nachweis der funktionellen Aktivitäten isolierter Darmschläuche in Echtzeit

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methode zur Isolierung von Darmschläuchen von Ratten vor und beurteilen den Einfluss von Medikamenten auf deren Spannung, Häufigkeit und Amplitude in vitro. Diese Methode bietet einen wertvollen Ansatz für Forscher, die Darmschläuche untersuchen.

Zusammenfassung

Magen-Darm-Erkrankungen, die eine hohe Inzidenz aufweisen, stellen den Menschen vor erhebliche Herausforderungen. Der Dünndarm ist ein wesentlicher Bestandteil der Verdauung und Absorption von Lebensmitteln und Medikamenten und spielt eine entscheidende Rolle bei der Behandlung dieser Krankheiten. Das Experiment zur Bewegung der Darmröhre, eine gängige und wesentliche In-vitro-Methode , wird zur Untersuchung der gastrointestinalen Dynamik eingesetzt. Dies umfasst die Aufbereitung des isolierten Darmschlauchs, sowie die Suspension des vorbereiteten Darmschlauchs im Bad und dessen Anschluss an einen Signaldetektor. Es folgt die Erfassung und Analyse einer Reihe von Parametern, wie z.B. die Spannung, die zur Beurteilung der Darmmotorik herangezogen werden kann, sowie Überlegungen zur Aufrechterhaltung der Aktivität des Darmschlauchs in vitro. Das standardisierte Programm von der Probenahme bis zur Datenerhebung verbessert die Wiederholbarkeit der experimentellen Daten erheblich und stellt die Authentizität der Erfassung der Darmspannung nach physiologischen, pathologischen und medikamentösen Eingriffen sicher. Hier stellen wir die Schlüsselprobleme im experimentellen Betrieb und ein wertvolles experimentelles Referenzprotokoll für die Untersuchung von Medikamenten vor, die die gastrointestinale Motilität regulieren.

Einleitung

Magen-Darm-Erkrankungen, eine weit verbreitete Erkrankung, haben schwerwiegende Auswirkungen auf das Leben und die Gesundheit der Menschen¹. Die gastrointestinale Motilitätsstörung ist ein wichtiger Bestandteil funktioneller Magen-Darm-Erkrankungen und äußert sich vor allem in schwächenden Symptomen, verzögerter Magenentleerung und schweren Magenproblemen². Es kann die Magen-Darm-Koordination stören, die Magenentleerung behindern, die Nahrungsmittelunverträglichkeit im Darm beeinflussen und sogar Funktionsstörungen im Dünn- oder Dickdarm verursachen³. Bei Patienten, die sich einer Magen-Darm-Operation unterziehen, kann diese Störung direkt zu Darmversagen führen. Darüber hinaus hängt die Darmerkrankung nicht nur mit Magen-Darm-Erkrankungen zusammen, sondern auch mit den pathogenen Faktoren verschiedener anderer Krankheiten wie Hepatitis und Erkrankungen des Zentralnervensystems. Die mikrobiellen Gemeinschaften des Darms spielen eine entscheidende regulatorische Rolle in der Darmphysiologie, einschließlich der Motilität, die in der Folge die Besiedlung innerhalb des mikrobiellen Ökosystems beeinflusst⁴. Wenn die Hepatitis-B-Virusinfektion zu einer chronischen Hepatitis B fortschreitet, kommt es zu unterschiedlich starken Veränderungen in der Darmflora. Die Modulation der Darmflora hat sich bei der Behandlung des Hepatitis-B-Virus als vorteilhaft erwiesen⁵. Darüber hinaus kann das zentrale Nervensystem den Darm beeinflussen und seine mikrobielle Zusammensetzung verändern. Jüngste Fortschritte in der Mikroflora-Sequenzierungstechnologie haben bidirektionale Wechselwirkungen zwischen der Darmflora und der Funktion des Zentralnervensystems aufgedeckt, die eng mit dem Auftreten und Fortschreiten von Erkrankungen des Zentralnervensystems verbunden sind ^6,7.

Mit dem Altern der Gesellschaft nimmt die Inzidenz von gastrointestinalen Motilitätsstörungen zu, die mit dem Rückgang oder Verlust der neuronalen Funktion im enterischen Nervensystem und der intrinsischen Innervation des Darms verbunden^{sind 8}. Mit zunehmendem Verständnis von Magen-Darm-Erkrankungen entstehen zahlreiche neue Ideen und Ansätze, die möglicherweise zu neuartigen Medikamentenentwicklungen führen. Viele dieser Ideen sind jedoch noch hypothetisch oder warten auf positive Ergebnisse klinischer Studien, um sich zu verwirklichen ^9,10. Effektive Forschungsmethoden sind entscheidend für die Überwindung von Magen-Darm-Erkrankungen. In den letzten Jahren hat sich die umfangreiche Forschung auf Magen-Darm-Medikamente und die Regulierung der Motilität konzentriert. Gastrointestinale Medikamente und gastrointestinale Dynamik sind untrennbar miteinander verbunden, und viele andere systemische Medikamente haben unterschiedliche Auswirkungen auf die gastrointestinale Dynamik. Zum Beispiel werden nichtsteroidale Antirheumatika (NSAIDs) gegen Schmerzen und Entzündungen sowie gegen langsame Magen-Darm-Bewegungen eingesetzt, wodurch das Risiko für Magengeschwüre erhöht^{wird 11}. Auf der anderen Seite können einige Antidepressiva die gastrointestinale Motilität beeinflussen¹². Derzeit ist das wichtigste pharmakologische In-vitro-Experiment, das die Auswirkungen von gastrointestinalen Arzneimitteln und anderen systemischen Arzneimitteln auf die gastrointestinale Motilität untersucht, der In-vitro-Darmbewegungsassay ¹³. Durch die Simulation physiologischer Bedingungen beobachten sie den direkten Einfluss von Medikamenten auf die Kontraktion und Entspannung der glatten Darmmuskulatur und bewerten ihre gastrointestinale Wirkung. Die genaue Ursache von gastrointestinalen Motilitätsstörungen bleibt jedoch unklar, wahrscheinlich ein komplexes Zusammenspiel von genetischen, umweltbedingten, ernährungsbedingten und neuroendokrinen Faktoren. Die Behandlung von gastrointestinalen Motilitätsstörungen stellt daher nach wie vor große Herausforderungen dar.

Der Dünndarm ist ein wichtiger Ort für die Verdauung, die Absorption und den Arzneimittelstoffwechsel und spielt eine wichtige Rolle für die Magen-Darm-Funktion. Daher ist der isolierte Test der Bewegung der Darmröhre ein wesentliches Instrument zur Untersuchung von Magen-Darm-Erkrankungen. Dabei wird der isolierte Darmschlauch des Tieres vorbereitet und in ein Bad gelegt, er an einen Energieaustauscher angeschlossen, ein Wandler verwendet, um mechanische Bewegungen in elektrische Signale zur Verstärkung umzuwandeln, und von einem physiologischen Rekorder aufgezeichnet. Verschiedene Parameter wie Frequenz, durchschnittliche Schwingungsamplitude, Spannung und Fläche unter der Kurve können gemessen werden, um die motorische Funktion des Darmschlauchs zu bewerten. Diese Methode bietet Vorteile wie Einfachheit, wirtschaftliche Machbarkeit, einfache Kontrolle der Versuchsbedingungen, minimale Einflussfaktoren, hohe Reproduzierbarkeit sowie genaue und zuverlässige Ergebnisse. Darüber hinaus ist es besonders nützlich für die Untersuchung des Wirkmechanismus von Arzneimitteln. Es gibt jedoch bemerkenswerte Herausforderungen bei der Durchführung des isolierten Darmröhrenexperiments, z. B. ist es schwierig, die Darmaktivität über einen längeren Zeitraum aufrechtzuerhalten. Um diese Fragen anzugehen und auf Erfahrungen in In-vitro-Experimenten zurückzugreifen, wird diese Arbeit eine detaillierte Einführung in die Schlüsselprobleme des experimentellen Betriebs geben und ein wertvolles experimentelles Referenzprotokoll für die Untersuchung von Arzneimitteln vorstellen, die die gastrointestinale Motilität regulieren.

Protokoll

Dieses Protokoll leitet sich aus der zuvor veröffentlichten Literatur^ab 14,15,16,17. Für die vorliegende Studie wurden männliche Sprague Dawley (SD) Ratten (260-300 g, 8-10 Wochen alt) verwendet. Das Tierprotokoll wurde vom Verwaltungsausschuss der Universität für Traditionelle Chinesische Medizin in Chengdu geprüft und genehmigt (Aktenzeichen 2023017). Vor dem Experiment wurden die Ratten angewiesen, 24 Stunden lang zu fasten. Während des Experiments wurden die Ratten in einer Tierkammer gehalten und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser.

1. Vorbereitung der Lösung

1. Bereiten Sie eine physiologische Salzlösung (PSS) vor, die 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl₂, 1,2 mM_KH2PO₄, 1,2 mM MgCl₂∙6H₂O, 25 mM NaHCO₃, 11 mM D-Glucose und 5 mM HEPES enthält (siehe Materialtabelle).
2. Tränken Sie die Lösungen und blasen Sie sie mit einem Mischgas aus 95 % O₂ und 5 % CO₂. Halten Sie in der Zwischenzeit die pH-Werte der Lösung zwischen 7,38 und 7,42 mit 2 mM NaOH.
3. 1/3 des PSS auf 4 °C abkühlen und den Rest auf 37 °C für nachfolgende Experimente vorwärmen.
   HINWEIS: Das PSS wurde ursprünglich bei Raumtemperatur in den Schritten 1.1-1.2 zubereitet

2. Dissektion des Darmkanals von Ratten

1. Sammeln Sie Petrischale, die mit 4 °C PSS, einer chirurgischen Pinzette und einer Schere gefüllt sind. Verabreichen Sie 2% Isofluran, um die Ratte durch Inhalation für ca. 5 Minuten zu betäuben. Stellen Sie sicher, dass die Ratte tief betäubt ist, indem Sie einen Zehenquetschtest durchführen. Falls erforderlich, verabreichen Sie zusätzliche Betäubungsmittel. Legen Sie anschließend den Darmkanal frei, indem Sie die Bauchhöhle auf einem Operationstisch öffnen.
2. Legen Sie die Magen- und Darmschläuche schnell in eine Petrischale, die mit 4 °C PSS (pH 7,40) gefüllt ist, wobei 95 % O₂ und 5 % CO₂ gesättigt sind. Lokalisieren Sie den Zwölffingerdarm, der den Anfang des Dünndarms bildet, im Pylorus des Magens. Heben Sie mit einer Pinzette das angrenzende Gewebe vorsichtig an und schneiden Sie es vorsichtig mit einer Schere vom Darmrand ab. Teilen Sie anschließend den Darm in 1-2 cm große Segmente; Dieser gesamte Prozess ist in Abbildung 1 dargestellt.

3. Suspension und Fixierung des Darmkanals (Abbildung 2)

1. Schalten Sie das In-vitro-Gewebeperfusionssystem ein und stellen Sie die Badtemperatur im Instrument auf 37 °C ein. Legen Sie den PSS (37 °C) in die Badewanne.
2. Bereiten Sie eine 15 cm lange chirurgische Naht vor (siehe Materialtabelle) und weichen Sie sie in 4 °C PSS ein, das mit 95 % O₂ + 5 % CO₂ gesättigt ist. Sichern Sie mit der Naht ein Ende des Darmkanals und verwenden Sie einen Stahlnadelhaken, um das andere Ende zu sichern.
3. Legen Sie den Darmschlauch an. Montieren Sie das Segment mit dem Stahlnadelhaken am Boden der Badewanne und befestigen Sie das andere Ende des chirurgischen Leitungss am Schallkopf. Schalten Sie den Gasschalter ein, damit Blasen in der Badewanne austreten können.
4. Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware (siehe Materialtabelle) und klicken Sie auf Start, um sicherzustellen, dass das entsprechende Wegsignal aufgezeichnet wird.

4. Normalisierung

1. Drehen Sie die Spiralachse des Bades gegen den Uhrzeigersinn, um die Darmschläuche in ihren natürlichen Zustand zu versetzen. Klicken Sie auf Setup-Zero All Inputs , um sicherzustellen, dass die Anfangsspannung des Darmschlauchs in der Software auf 0 g eingestellt ist.
2. Drehen Sie die Spiralachse des Bades gegen den Uhrzeigersinn, um den Spannungswert auf 1 g zu ziehen und ihn 30 min lang im pH-Wert = 7,40, 95 % O₂ + 5 % CO₂ gesättigt 37 °C PSS zu stabilisieren.
   HINWEIS: Die Normalisierung des Darmschlauchs dient dazu, seine Vorlast auf einen optimalen Zustand einzustellen. Für Kavitätenproben war eine optimale Vorlast erforderlich, um eine außergewöhnliche Aktivität in vitro aufrechtzuerhalten. Die optimale Vorlast des Ratten-Darmschlauchs betrug 1 g¹⁸.

5. Nachweis von Reaktivität

1. Beobachten Sie die rhythmischen spontanen Kontraktionswellen in der Software und fahren Sie mit dem nächsten Experiment fort, da dies auf eine ausreichende Reaktion hinweist.

6. Experimentelle Beobachtung

1. Geben Sie das Testmedikament (z. B. Acetylcholin usw.) in das Bad, um die Wirkung des Arzneimittels auf die Darmschlauchfunktion zu untersuchen.
   HINWEIS: Die Wirkung des Arzneimittels wurde durch den Vergleich von Veränderungen der Darmverengungskurve vor und nach der Verabreichung bewertet. Wenn das Medikament hinzugefügt wird, ist es angebracht, die Blase zu erhöhen, um das Medikament zu mischen, und dann die Blase nach dem Mischen auf normal einzustellen.

7. Datenanalyse

HINWEIS: Das In-vitro-Gewebeperfusionssystem verfügt über vier Kanäle, mit denen gleichzeitig Tests zur Wirkung von vier identischen oder unterschiedlichen Arzneimitteln auf vier Darmschläuche durchgeführt werden können. Da die experimentellen Parameter und Analysemethoden für alle Kanäle gleich sind, wird ein Kanal als Beispiel für die Datenanalyse ausgewählt.

1. Stoppen Sie die Datenerfassungssoftware und führen Sie eine Datenanalyse mit dieser Datenerfassungssoftware durch. Bearbeiten Sie die Datenplatine und wählen Sie die Analyseparameter wie folgt aus: Klicken Sie auf Fenster-Datenpad und wählen Sie die durchschnittliche Spannung für den Kanal aus.
2. Wählen Sie die Kontraktionskurve vor der Verabreichung aus und klicken Sie auf Zum Datenpad hinzufügen. Wählen Sie die Kontraktionskurve nach der Verabreichung aus und klicken Sie auf Zum Datenpad hinzufügen. Der durchschnittliche Spannungswert vor und nach der Verabreichung wird nacheinander auf dem Datenpad angezeigt.
3. Klicken Sie auf Fenster-Datenpad, um die Daten für die statistische Analyse in eine andere statistische Analysesoftware (siehe Materialtabelle) zu kopieren.
4. Analysieren Sie andere Parameter, wie z. B. die durchschnittliche Amplitude, die durchschnittliche Frequenz und das Integral (Bereich unter der Kurve), ersetzen Sie einfach die durchschnittliche Spannung durch den entsprechenden Parameter, und die Operation ist die gleiche wie in den Schritten 6.1-6.3.
5. Kontraktionskurve speichern: Wählen Sie die Kontraktionskurve aus, klicken Sie auf Bearbeiten-Kopieren Labchart-Daten , um die Daten in eine Zeichnungssoftware zu kopieren (siehe Materialtabelle), um die Kontraktionskurve zu zeichnen.

8. Postoperative Behandlung

1. Nach der Operation werden die Tiere nach institutionell anerkannten Protokollen eingeschläfert.
   HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden die Tiere durch Einatmen von überschüssigem Isofluran euthanasiert.

Ergebnisse

Der erste Teil der Studie konzentriert sich auf den Prozess der Trennung isolierter Darmschläuche vom Körper und deren Umwandlung in 2 cm große Röhren in vitro. Dieser Prozess ist in Abbildung 1 detailliert dargestellt. Der zweite Teil befasst sich mit der Suspension und Standardisierung des isolierten Darmschlauchrings. Der Erfolg dieses Prozesses ist in Abbildung 2 dargestellt, die die automatische rhythmische Kon...

Diskussion

Die gastrointestinale Motilität wird durch eine Reihe von genau aufeinander abgestimmten Kontraktionen und Entspannungen der glatten Muskulatur erreicht. Dieser Prozess beinhaltet die rhythmische Kontraktion einer Gruppe von Muskelgruppen, die koordinierte Kontraktion mehrerer Gruppen und eine spezielle treibende Kontraktion ^20,21. Das Auftreten von gastrointestinalen Motilitätsstörungen kann mit Funktionsstörungen auf versch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	Sigma, USA	A6625
atropine	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	IA06501
Barium chloride	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	B861682
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
drawing software	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Epinephrine	Sigma, USA	E4642
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
In vitro tissue perfusion system	PowerLab, ADInstruments, Australia	ML0146
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
nifedipine	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	N5087
statistical analysis software	GraphPad Software, San Diego, California, USA	—
Surgical sutures	Johnson, USA	—