Ein nahtloser Klonierungsansatz für die Konstruktion von Expressionsvektoren für das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um den pVAX1-PRRSV-Expressionsvektor durch Einführung geeigneter Restriktionsstellen am 3'-Ende der Inserts zu erhalten. Wir können den Vektor linearisieren und DNA-Fragmente durch homologe Rekombinationstechnologie nacheinander mit dem Vektor verbinden.

Zusammenfassung

Die Konstruktion von Genexpressionsvektoren ist ein wichtiger Bestandteil der Laborarbeit in der experimentellen Biologie. Mit technischen Fortschritten wie Gibson Assembly wird die Vektorkonstruktion relativ einfach und effizient. Wenn jedoch das Genom des Porcinen Reproduktiven und Respiratorischen Syndroms Virus (PRRSV) nicht einfach durch eine einzelne Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus cDNA amplifiziert werden kann oder es schwierig ist, einen Genexpressionsvektor in voller Länge durch homologe Rekombination mehrerer Inserts in vitro zu erhalten, kann die derzeitige Gibson-Assemblierungstechnik dieses Ziel nicht erreichen.

Daher zielten wir darauf ab, das PRRSV-Genom in mehrere Fragmente zu zerlegen und geeignete Restriktionsstellen in den reversen Primer einzuführen, um PCR-amplifizierte Fragmente zu erhalten. Nach dem Verbinden des vorherigen DNA-Fragments mit dem Vektor durch homologe Rekombinationstechnologie erhielt der neue Vektor die Spaltstelle des Restriktionsenzyms. So können wir den Vektor linearisieren, indem wir die neu hinzugefügte Enzymspaltstelle verwenden und das nächste DNA-Fragment stromabwärts des stromaufwärts gelegenen DNA-Fragments einführen.

Die eingeführte Spaltstelle des Restriktionsenzyms am 3'-Ende des stromabwärts gelegenen DNA-Fragments wird eliminiert, und eine neue Spaltstelle wird in das 3'-Ende des stromabwärts gelegenen DNA-Fragments eingeführt. Auf diese Weise können wir DNA-Fragmente nacheinander mit dem Vektor verbinden. Diese Methode ist anwendbar, um den PRRSV-Expressionsvektor erfolgreich zu konstruieren, und ist eine effektive Methode zum Assemblieren einer großen Anzahl von Fragmenten in den Expressionsvektor.

Einleitung

Als wesentliche Technik zur Konstruktion von DNA-basierten experimentellen Werkzeugen für die Expression in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen ist die molekulare Klonierung ein sehr wichtiger Bestandteil der experimentellen Biologie. Die molekulare Klonierung umfasst vier Prozesse: die Gewinnung von Insert-DNA, die Ligation des Inserts in den entsprechenden Vektor, die Umwandlung des rekombinanten Vektors in Escherichia coli (E. coli) und die Identifizierung der positiven Klone¹. Bisher wurden mehrere Methoden zur Verbindung von DNA-Molekülen unter Verwendung der Restriktionsenzyme ^2,3....

Protokoll

1. Vorbereitung des Templates des PRRSV-Gens

1. Tauen Sie den Virusbestand in 1 ml RNA-Extraktionsreagenz auf (siehe Materialtabelle).
2. 0,2 mL Chloroform zugeben und gründlich mischen. 3 Min. inkubieren.
3. Die Mischung 15 min bei 12.000 × g bei 4 °C zentrifugieren.
   HINWEIS: Das Gemisch ist in drei Phasen unterteilt, nämlich eine farblose wässrige Phase, eine Interphase und eine rote Phenol-Chloroform-Phase.
4. Pipettieren Sie die farblose wässrige Phase heraus und übertragen Sie sie in ein neues Röhrchen.
5. Die wässrige Phase gründlich mit 0,5 mL Isopropanol mischen und 10 min bei 4 °....

Diskussion

Die Gibson-Assemblierungstechnik ist eine auf In-vitro-Rekombination basierende molekulare Klonierungsmethode zur Assemblierung von DNA-Fragmenten⁸. Diese Methode ermöglicht den Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente zu einem zirkulären Plasmid in einer isothermen Reaktion mit einem einzigen Röhrchen. Eines der Hindernisse für die Gibson-Assemblierungstechnik ist jedoch die Gewinnung langer Fragmente aus cDNA. Die langen Fragmente sind aus vielen Gründen schwer genau zu vervielfältigen........

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA Ladder	Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd	MD113-02
2x Universal Green PCR Master Mix	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A303-1
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	9012-36-6
Benchtop Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FRESCO17
Clean Bench	Sujing Antai Air Technology  Co., Ltd	VD-650-U
DNA Electrophoresis Equipment	Cleaver Scientific  Co., Ltd	170905117
DNA Loading Buffer (6x)	Biosharp Biotechnology Co., Ltd	BL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kit	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D6943-01
Electro-heating Standing-temperature Cultivator	Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd	DHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNase	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0303
FastDigest HindIII	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0504
FastDigest NheI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0974
FastDigest NotI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0596
Gel Doc XR	Bio-Rad Laboratories Co., Ltd	721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel Stain	Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd	YB10201ES03
Ice Maker Machine	Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd	FMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113-0001
Micropipettors	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	—
Microwave Oven	Panasonic Electric (China) Co., Ltd	NN-GM333W
Orbital Shakers	Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd	ZHWY-2102C
PRRSV virus	Sichuan Agricultural University	—
SnapGene	GSL Biotech, LLC	v5.1	To design primers
T100 PCR Gradient Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories  Co., Ltd	T100 Thermal Cycler
TAE buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B040123-0010
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	15596026	RNA extraction reagent