Chirurgische Perfusion und Isolierung der Bauchspeicheldrüse des Schweins zur Inselisolierung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Entnahme einer Bauchspeicheldrüse des Schweins für die Isolierung und Reinigung von Inselzellen.

Zusammenfassung

Die Transplantation von Pankreasinseln ist eine aufstrebende Behandlung von Typ-I-Diabetes. Sie ist jedoch durch die Zuordnung und Verfügbarkeit von Spendern begrenzt. Die Xenotransplantation von Schweineinseln bietet eine vielversprechende Alternative zur Allotransplantation mit dem Potenzial für die großtechnische Produktion von funktionellen Inselzellen auf Abruf. Die Ausbeute und Lebensfähigkeit isolierter Inselzellen hängt stark von der Qualität der Spender-Bauchspeicheldrüse und der Art der Gewinnung ab, insbesondere von der Dauer der Warm-Ischämie-Zeit. Um die Organkonservierung und die anschließende Ausbeute und Lebensfähigkeit der Inselzellen zu verbessern, haben wir ein Protokoll für die chirurgische Perfusion und Resektion der Bauchspeicheldrüse des Schweins entwickelt. Dieses Protokoll verwendet eine direkte infrarenale Aortenkanüle und Organperfusion, um sowohl die Zeit der warmen Ischämie zu minimieren als auch das Verfahren für Bediener zu vereinfachen, die nicht über umfangreiche chirurgische Erfahrung verfügen. Durch die anschließende arterielle Perfusion der Bauchspeicheldrüse über die Aorta wird stagnierendes Blut aus den Mikrogefäßen gespült, wodurch Thrombosen und oxidative Schäden am Gewebe reduziert werden. Dieses Manuskript enthält ein detailliertes Protokoll für die chirurgische Perfusion und Resektion der Bauchspeicheldrüse des Schweins, gefolgt von der Isolierung und Reinigung der Inselzellen.

Einleitung

Typ-1-Diabetes wird durch die autoimmune Zerstörung von Betazellen der Bauchspeicheldrüse verursacht¹. Folglich sind die Patienten auf exogenes Insulin angewiesen, was sie einem hohen Risiko für glykämische Schwankungen mit Episoden von Hyper- und Hypoglykämie aussetzt². Die Insel-Allotransplantation ist ein potenzielles Heilmittel für Typ-I-Diabetes. Die begrenzte Verfügbarkeit von Organspendern für die Bauchspeicheldrüse ist jedoch nach wie vor ein großes Hindernis für die breite Einführung des Verfahrens ^2,3. Die Insel-Xenotra....

Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren sind vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Washington University School of Medicine Division of Comparative Medicine genehmigt. Erwachsene Yorkshire-Schweine mit einem Gewicht von 35 bis 35 kg sind ideal für dieses Verfahren. Das Protokoll kann jedoch je nach Versuchskontext für Schweine unterschiedlicher Größe angepasst werden. Der gesamte Eingriff sollte steril in einem Operationssaal durchgeführt werden.

1. Präoperative Vorbereitung und Anästhesie

1. Das Schwein wird mit einem Cocktail aus 4 mg/kg Tiletamin und Zolazepam, 20 mg/kg....

Diskussion

Die Xenotransplantation von Pankreasinseln mit Schweinespendern ist eine vielversprechende Strategie zur Behandlung von Typ-I-Diabetes. Die Isolierung von Inselzellen ist eine Herausforderung, und die Lebensfähigkeit und Ausbeute der endgültigen Inselzellen sind sehr anfällig für Hypotonie und Gewebeischämie, die bei der Organentnahme auftreten^16,17. Um die Beschaffung und den Erhalt der Bauchspeicheldrüse zu optimieren, st.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M NaOH, 100 mL	Millipore Sigma	1310-73-2
10x HBSS, 500 mL (15 to 30 °C)	Thermo Fisher	14065056
1x D-PBS, 500 mL	Thermo Fisher	14200075
1x HBSS, 1 L	Thermo Fisher	14025076
250 mL Conical Tubes	Millipore Sigma	CLS430236-6EA
Amphotericin B [50 mg]	Millipore Sigma	PHR1662
Antiseptic Povidone Iodine 10%	Millipore Sigma	25655-41-8
BioRad Gradient Former	BioRad	395
Calcium Chloride dihydrate	Thermo Fisher	10035-04-8
COBE Cell Processor	Ebay	317690
Digestion circuit reservoir, Gibco bottle, 1 L	Thermo Fisher	10341001
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher	85190
Dithizone	Thermo Fisher	60-10-6
Gradient Former Connection Kit	BioRad	1652008
Heparin [1000 U/mL]	Emergency Medical Products	0409-2720-01
HEPES Buffer (1 M), 100 mL	Thermo Fisher	15630080
Human Serum Albumin 25%, 100 mL	Celprogen	HSA2001-25-1
Isoflurane	Covetrus	Item#:11695067772
Ketamine	Patterson	Item #:07-894-8462
Liberase (100 mg)	Millipore Sigma	5401020001
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher	L3224
Lympholyte 1.1 Media 500 mL	Cedarlane Labs	CL5020
Masterflex LS 16 Tubing	Masterfle	96419-16
Masterflex Peristaltic Pump	Masterflex	07522-30
PenStrep (2 mg/mL)	Celprogen	PS-30-002
Pulmozyme (1 mg/mL, 2.5 mL/vial)	Dornase Alfa	8931278
Recovery Medium, PIM(R)	Prodo Laboratories, Inc.	PIM-R001GMP
RPMI 1640	Millipore Sigma	R8758-1L
Standard Culture Medium, PIM(S)	Prodo Laboratories, Inc.	PIM-S001GMP
Tzed™ (tiletamine and zolazepam) Injection C	Patterson	Item #:07-894-6240
University of Wisconsin (UW) Solution, 3 L	Global Transplant Solutions	1000-0046-06
Waterbath	Sigma Alderich	CLS6783-1EA
Xylazine	Patterson	Item #:07-891-6165