MLH1 Genexpression im peripheren Blut bei Darmkrebspatienten und ihre Assoziation mit Dickdarmkrebs

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht den Zusammenhang zwischen der MLH1-Genexpression im peripheren Blut und bei Dickdarmkrebs unter Verwendung eines Fall-Kontroll-Ansatzes, um die Expressionsniveaus bei Patienten mit gesunden Kontrollen zu vergleichen.

Zusammenfassung

MutL-Homolog 1 (MLH1) ist eine Komponente des heterodimeren Komplexes MutLα, der Basen-Basen-Fehlanpassungen und Insertions-/Deletionsschleifen, die durch Nukleotid-Fehleinbau verursacht werden, erkennt und repariert. In Abwesenheit des MLH1-Proteins nimmt die Häufigkeit von nicht reparierten Fehlpaarungen zu, was zu Organkrebs führt. In der aktuellen Studie wurde versucht, die MLH1-Genexpression und ihre Beziehung zur Tumorinvasion (T) und Lymphknoteninvasion (N) in Blutproben von Patienten mit Darmkrebs (CRC) zu quantifizieren. Es wurden Blutproben von 36 Darmkrebspatienten entnommen. RNA wurde extrahiert und cDNA mit einem Kit synthetisiert. Die Primer wurden mit dem Exon-Exon-Junction-Ansatz erstellt, und MLH1 - und β-Aktin-Gene wurden 3x mit Hilfe der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (Real-Time PCR) getestet. Zur Analyse der Daten wurde eine Software zur Analyse der Genexpression verwendet, und ein t-Test wurde verwendet, um die Expression von MLH1 und seine Verbindung mit T- und N-Variablen zu untersuchen. In dieser Studie wurden 36 Patienten mit Darmkrebs, darunter 15 (41,6%) Frauen und 21 (58,4%) Männer, mit einem Durchschnittsalter von 57,35 ± 4,22 Jahren und im Alter von 26-87 Jahren eingeschlossen. Die Ergebnisse zeigten, dass das Verhältnis der MLH1-Genexpression bei Patienten im Vergleich zu gesunden Personen abnahm und die Abnahme der Genexpression in verschiedenen Stadien der Erkrankung signifikant war. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die Verringerung der MLH1-Genexpression eine wirksame Rolle bei der Entwicklung von Darmkrebs spielt.

Einleitung

Darmkrebs (Darmkrebs) ist eine der häufigsten Krebsarten. Sie ist die vierthäufigste krebsbedingte Todesursache weltweit¹. Darmkrebs ist bei Männern häufiger als bei Frauen, in Industrieländern drei- bis viermal häufiger als in Entwicklungsländern. Die altersstandardisierte (globale) Inzidenzrate pro 1 x 10⁵ der Darmkrebs-Inzidenzen beträgt 19,7 bei beiden Geschlechtern, 23,6 bei Männern und 16,3 bei Frauen². Epidemiologische Studien haben starke Umwelt- und Lebensstilassoziationen mit Darmkrebs gezeigt. Fettleibigkeit, rotes/verarbeitetes Fleisch, Tabak, Alkohol, Androgenentzugstherapie und Cholezystektomie sind alle mit einem moderat erhöhten Darmkrebsrisiko verbunden ^2,3.

Chromosomale Instabilität, Mikrosatelliteninstabilität und der CpG-Inselmethylator-Phänotyp (CIMP) spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorgenese des SFB⁴. Früheren Studien zufolge wurden bei Patienten mit Darmkrebs etwa 250 verschiedene Mutationen identifiziert, was etwa 55 % der bekannten Mutationen im Zusammenhang mit Genen für die DNA-Mismatch-Reparatur (MMR) entspricht. Defekte in Mismatch-Reparaturproteinen können durch Keimbahnmutationen in den Genen MSH6, MLH1, PMS2 und MSH2 verursacht werden, und die meisten dieser Mutationen finden sich in den Genen MLH1 und MSH2 ^4,5. Das wichtigste Protein im MMR-System, das in der Regel an Darmkrebs beteiligt ist, ist MLH1. Neuere Studien haben gezeigt, dass jede Veränderung der MLH1-Expression das Risiko für Darmkrebs erhöhen kann. Keimbahnmutationen in MLH1 sind für das Lynch-Syndrom verantwortlich, eine vererbte Form von Darmkrebs. Darüber hinaus werden 13%-15% der Fälle von diffusem Dickdarmkrebs durch einen MLH1-Mangel verursacht, der auf einer somatischen Promotor-Hypermethylierung beruht ^6,7,8.

Das MLH1-Gen befindet sich auf dem kurzen Arm von Chromosom 3 an Position 22.2 und enthält 21 Exons⁹. Das Protein, das vom MLH1-Gen kodiert wird, kann mit einer Endonuklease, die an der Mismatch-Reparatur beteiligt ist, PMS2, zusammenarbeiten, um MutLα zu erzeugen, das Teil des MMR-Systems ist. MutLα ist hauptsächlich an der Reparatur von Basen-Basen-Fehlpaarungen sowie Deletions- und Additionsschleifen als Folge unvollständiger DNA-Replikation beteiligt. Darüber hinaus ist das kodierte Protein an der Signalübertragung von DNA-Schäden beteiligt und kann mit dem MLH3-Protein, das an der Reparatur von DNA-Fehlanpassungen beteiligt ist, in die ɣMutL-Form umgewandelt werden, die in der Meiose beobachtet wurde 10,11,12. Studien haben gezeigt, dass MLH1 an anderen wichtigen zellulären Aktivitäten beteiligt ist, einschließlich der Regulation von Zellzyklus-Checkpoints, Apoptose, Crossover-Rekombination und mitotischer Inkompatibilität¹³.

Das MLH1-Gen spielt eine Schlüsselrolle im System der DNA-Mismatch-Reparatur (MMR). Ein Defekt in der Funktion dieses Gens kann zur Häufung genetischer Mutationen und in der Folge zur Entwicklung von Darmkrebs führen¹⁴. Frühere Studien haben gezeigt, dass etwa 55% der Mutationen, die mit MMR-Genen bei Patienten mit Darmkrebs assoziiert sind, mit MLH1-Genmutationen zusammenhängen. Darüber hinaus kann eine verminderte MLH1-Genexpression zum Lynch-Syndrom führen, einer vererbten Form von Darmkrebs ^15,16. Außerdem wurde ein MLH1-Gendefekt auf der Grundlage einer somatischen Promotor-Hypermethylierung bei 13 % bis 15 % der sporadischen Darmkrebsfälle beobachtet¹⁷. Diese wissenschaftlichen Erkenntnisse zeigen, dass das MLH1-Gen als wichtiger Biomarker bei Darmkrebs fungiert und seine Expressionsanalyse wertvolle Informationen über die Funktion des MMR-Signalwegs und das genetische Risiko von SFB¹⁸ liefern kann. Die Messung der MLH1-Expressionsniveaus im peripheren Blut von Patienten mit Dickdarmkrebs kann wertvolle Informationen über die Funktionalität des MMR-Signalwegs liefern, der bei Dickdarmkrebs häufig gestört ist. Diese Methode kann zu prognostischen Zwecken und zum Verständnis der genetischen Anfälligkeit für Darmkrebs eingesetzt werden^19,20. Eine Studie über den Zusammenhang zwischen der G-zu-C-Mutation des MLH1-415-Locus und sporadischem Darmkrebs bei chinesischen Patienten ergab, dass die Häufigkeit des MLH1 C/C-Genotyps bei sporadischen Darmkrebspatienten signifikant höher war als bei Kontrollen, was auf eine genetische Anfälligkeit für sporadischen Darmkrebs bei chinesischen Patienten hindeutet²¹. Eine weitere Studie verglich die Genexpression von genetischen Biomarkern für Darmkrebs in peripheren Blut- und Biopsieproben von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) und unterstrich das Potenzial der Genexpressionsanalyse im peripheren Blut für das Verständnis von Biomarkern im Zusammenhang mit Dickdarmkrebs²².

In Anbetracht der wichtigen Rolle des MLH1-Gens und der in den letzten Jahrzehnten durchgeführten Studien mit molekularer Analyse durch Profilierung der mRNA-Expression wurden Krebserkrankungen mit höherer Genauigkeit klassifiziert. Ziel dieser Studie war es, die Expression von MLH1 in peripheren Blutproben von Patienten mit Darmkrebs mittels real-time PCR quantitativ zu untersuchen und seine Beziehung zu pathologischen Faktoren, Stadien der Tumorprogression zu den Schichten der Darmwand (T) und Stadien der Invasion zu Lymphknoten (N) zu untersuchen. Diese Studie wurde an 36 Darmkrebspatienten durchgeführt, um möglicherweise quantitative Veränderungen in der Genexpression als Biomarker für das Darmkrebs-Screening, die Prognose und die Diagnose anhand von peripheren Blutproben zu etablieren.

Protokoll

Zwischen April 2021 und Mai 2023 wurde am Affiliated Hospital 2 der Nantong University eine Fall-Kontroll-Studie durchgeführt. Setzen Sie sich mit der Verwaltungsabteilung des Krankenhauses in Verbindung, um den Studienrahmen festzulegen. Die ethische Genehmigung wurde durch die Einreichung des Studienvorschlags bei der Ethikkommission der Universität Nantong eingeholt. Ethische Richtlinien wurden befolgt, um Vertraulichkeit und informierte Zustimmung zu gewährleisten.

1. Patientenrekrutierung und Studiendesign

1. Stichprobenentnahme für den Einschluss der Teilnehmer in die Studie
   1. Untersuchen Sie die Expression des MLH1-Gens im peripheren Blut von 36 Personen mit Dickdarmkrebs und einer Kontrollgruppe. Entwickeln Sie klare Ein- und Ausschlusskriterien für die Auswahl der Teilnehmer.
   2. Rekrutieren Sie Personen, bei denen bestimmte Arten von Dickdarmkrebs diagnostiziert wurden (Rektosigmoid, Blinddarmkrebs, aufsteigender, transversaler und absteigender Dickdarmkrebs, die als kolorektale Tumoren angesehen wurden) und über eine informierte Einwilligung verfügen.
   3. Schließen Sie Personen mit anderen Krebsdiagnosen oder -erkrankungen aus, die die Genexpressionsanalyse beeinträchtigen könnten. Schließen Sie außerdem Teilnehmer aus, bei denen in den letzten 3 Monaten Bluttransfusionen in der Vorgeschichte, in den letzten 6 Monaten eine Chemotherapie oder Strahlentherapie in der Vorgeschichte, Alkohol- oder Drogenkonsum in der Vorgeschichte und Autoimmunerkrankungen oder entzündliche Darmerkrankungen in der Vorgeschichte aufgetreten sind.
2. Kategorisierung klinischer Risikofaktoren nach dem TNM-Staging-System (Tumor, Nodes, and Metastasis) unter Berücksichtigung der Krebsmasse, der Tumorgröße und der Invasion in benachbarte Organe^23,24.
   1. Unterteilen Sie verschiedene Krebsstadien (0-4) basierend auf den verfügbaren Daten aus der Pathologiedatei.
   2. Segmentieren Sie die Rate des Tumorwachstums und der Progression in den Darmwandschichten (T-Index) in vier verschiedene Gruppen (T1-4, T0-TX) und die Lymphknoteninvasion (N-Index) in vier Gruppen (N1-3, N0-NX).
3. Bereiten Sie eine Kontrollgruppe mit gesunden Personen vor.
   1. Ordnen Sie die Kontrollgruppe in Bezug auf Alter und Geschlecht der Patientengruppe zu. Sammeln Sie detaillierte demografische Daten für jeden Teilnehmer, um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
4. Verfahren zur Einwilligung nach Aufklärung
   1. Bereiten Sie Einwilligungserklärungen vor, in denen der Zweck, die Verfahren und die potenziellen Risiken der Studie erläutert werden.
   2. Interagieren Sie mit den Teilnehmern und geben Sie ihnen ausreichend Zeit, Fragen zu stellen. Sammeln Sie unterschriebene Einwilligungserklärungen, bevor Sie mit der Probenentnahme fortfahren.

2. Extraktion und Reinigung von RNA

1. Entnahme von peripheren Blutproben
   1. Besorgen Sie sich handelsübliche EDTA-beschichtete Röhrchen, die für den klinischen oder Laborgebrauch zertifiziert sind. Überprüfen Sie das Verfallsdatum der Tuben. Überprüfen Sie die Unversehrtheit der Tubenverpackung.
   2. Weisen Sie den Teilnehmer an, bequem zu sitzen. Entnehmen Sie mit einer sterilen Spritze 5 ml Blut aus der Vena antecubitalis. Stellen Sie sicher, dass der Teilnehmer entspannt ist und den Arm ausstreckt, um die Vene freizulegen. Füllen Sie die Blutproben sofort in die vorbereiteten Röhrchen und stellen Sie sicher, dass sie nur minimal mit Luft in Berührung kommen.
   3. Halten Sie die Proben während des Transports zum Labor bei 4 °C, um die Integrität der RNA zu erhalten.
2. Verwenden Sie ein RNA-Blut-Mini-Kit für die RNA-Isolierung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   1. Kurz gesagt, lysieren Sie die roten Blutkörperchen, indem Sie die Vollblutprobe mit Buffer EL auf Eis inkubieren. Zentrifugieren Sie, um die Leukozyten zu pelletieren, und verwerfen Sie den Überstand. Lysieren Sie die Leukozyten mit Buffer RLT und homogenisieren Sie das Lysat mit einer Shredder-Säule.
   2. Ethanol zum homogenisierten Lysat geben und in eine Spin-Säule überführen. Waschen Sie die Säule mit Buffer RW1 und Buffer RPE. Eluieren Sie die gereinigte RNA, indem Sie RNase-freies Wasser in die Säule geben und zentrifugieren.
3. Bewertung der RNA-Menge und -Qualität
   1. Quantifizierung von RNA: Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die RNA-Konzentration und -Reinheit zu messen. Öffnen Sie die Software auf dem angeschlossenen Computer. Wählen Sie die Option Nukleinsäure aus dem Hauptmenü. Tragen Sie 1 μl RNA-Probe auf die Probenfläche auf.
   2. Testen Sie die Reinheit und Integrität der RNA
      HINWEIS: Die Integrität und Größenverteilung der Gesamt-RNA, die mit dem RNA-Blut-Mini-Kit gereinigt wurde, kann durch Spektralphotometrie und Gelelektrophorese überprüft werden. Ribosomale RNAs sollten als scharfe Banden oder Peaks erscheinen. Das scheinbare Verhältnis von 28S rRNA zu 18S rRNA sollte etwa 2:1 betragen. wenn die ribosomalen Banden oder Peaks einer bestimmten Probe nicht scharf sind, sondern als Abstrich in Richtung kleinerer RNAs erscheinen; Es ist wahrscheinlich, dass die Probe entweder vor oder während der RNA-Aufreinigung stark abgebaut wurde.
      1. Senken Sie für die spektrophotometrische Messung den Arm des Geräts ab und klicken Sie auf Messen , um das Verhältnis A260/A280 zu erhalten. Bewerten Sie die Reinheit der RNA-Probe mit dem Ziel eines A260/A280-Verhältnisses zwischen 1,8 und 2,0.
      2. Führen Sie eine 1%ige Agarose-Gelelektrophorese wie unten beschrieben durch.
         1. Bereiten Sie die 1%ige Agaroselösung vor, indem Sie Agarosepulver in TAE-Puffer erhitzen, bis es sich aufgelöst hat. Geben Sie Ethidiumbromid zur Agaroselösung, um eine Endkonzentration von 0,5 μg/ml zu erreichen. Gießen Sie die Agarose-Ethidiumbromid-Lösung in eine Gel-Gießschale und lassen Sie sie sich verfestigen.
            HINWEIS: Ethidiumbromid ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der mit RNA interkaliert, um eine Visualisierung unter UV-Licht zu ermöglichen.
         2. Mischen Sie die RNA-Proben mit Ladefarbstoff und laden Sie sie vorsichtig in die Vertiefungen des erstarrten Gels. Lassen Sie die Gelelektrophorese ca. 30 Minuten lang bei 100 V laufen, um die RNA-Fragmente nach Größe zu trennen. Visualisieren Sie die RNA-Banden, indem Sie das Gel auf einen UV-Transilluminator oder ein Bildgebungssystem legen, wodurch die mit Ethidiumbromid gefärbte RNA fluoresziert.
4. Lagerung der extrahierten RNA
   1. Entnehmen Sie die extrahierten RNA-Proben. Aliquotieren Sie die RNA in sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Volumen von 10 μl pro Aliquot. Lagern Sie die RNA-Aliquoten bei -80 °C oder niedriger.
5. Reverse Transkription von RNA in cDNA
   1. Befolgen Sie das Protokoll des Reverse-Transkriptionskits. Tauen Sie auf und bereiten Sie die notwendigen Reagenzien auf Eis und bei Raumtemperatur vor.
   2. Führen Sie eine genomische DNA-Eliminierungsreaktion durch, um alle genomischen DNA-Kontaminationen zu entfernen.
   3. Bereiten Sie den reversen Transkriptions-Mastermix auf Eis vor, der alle Komponenten außer der Template-RNA enthält.
   4. Fügen Sie die Template-RNA aus dem DNA-Eliminierungsschritt zum Reverse-Transkriptions-Mastermix hinzu. Inkubieren Sie die reverse Transkriptionsreaktion 15 Minuten lang bei 42 °C.
   5. Inaktivieren Sie das Reverse-Transkriptase-Enzym, indem Sie es 3 Minuten lang bei 95 °C inkubieren. Verwenden Sie ein Aliquot der fertigen cDNA für die sofortige Real-Time-PCR oder lagern Sie die cDNA bei -20 °C für die spätere Verwendung.

3. Primer-Design für die Real-Time-PCR

1. Auswahl von Zielgenen und internen Kontrollen
   1. Wählen Sie das MLH1-Gen als Ziel für die Quantifizierung, da es mit Darmkrebs assoziiert ist. Wählen Sie β-Aktin als interne Kontrolle für die Normalisierung der Genexpressionsdaten aus.
2. Designprozess des Primers
   1. Starten Sie die Primer-Design-Software und geben Sie die Gensequenz von MLH1 ein, die aus dem Ensemble- oder UCSC-Genombrowser erhalten wurde.
   2. Stellen Sie die Schmelztemperatur (Tm) für Primer zwischen 58 und 60 °C, den optimalen GC-Gehalt auf 40 % bis 60 % und die Primerlänge zwischen 18 und 24 Nukleotiden ein.
   3. Geben Sie die entworfenen Primersequenzen in die NCBI BLAST-Datenbank ein, um die Spezifität zu bestätigen.
      1. Gehen Sie auf die BLAST-Website und wählen Sie Nucleotide BLAST. Fügen Sie die Primer-Sequenzen in das Suchfeld ein und klicken Sie auf BLAST.
      2. Analysieren Sie die Ergebnisse, um sicherzustellen, dass keine Off-Target-Amplifikation vorhergesagt wird. Einzelheiten siehe Tabelle 1 .

4. Echtzeit-PCR

1. Aufbau einer Echtzeit-PCR-Reaktion. Einzelheiten siehe Tabelle 2 .
   1. Zentrifugieren Sie die Reagenzien 5 Minuten lang bei 4 °C bei 10.000 x g , um den Inhalt am Boden der Röhrchen zu sammeln.
   2. Bereiten Sie einen Mastermix gemäß dem kommerziellen Kit-Protokoll vor, der SYBR Green, Puffer, dNTPs, MgCl₂ und Taq-Polymerase enthält.
   3. Ordnen Sie den Mastermix markierten PCR-Röhrchen zu und stellen Sie so die Konsistenz des Volumens über die Proben hinweg sicher.
   4. Geben Sie das entsprechende Volumen an Vorwärts- und Rückwärtsprimern für MLH1 und β-Aktin in die jeweiligen Röhrchen.
   5. Verdünnen Sie die RNA-Proben vor der reversen Transkription auf eine konstante Konzentration von 100 ng/μl und transkribieren Sie sie mit einem reversen Transkriptionskit in cDNA.
2. Amplifikation und Datenerfassung
   1. Legen Sie die PCR-Röhrchen in das real-time PCR-System.
   2. Programmieren Sie den Thermocycler mit den optimierten Zyklusbedingungen: 95 °C für 20 s für die Denaturierung, 54 °C für 30 s für das Glühen und 72 °C für 30 s für die Verlängerung. Einzelheiten siehe Tabelle 3 .
   3. Stellen Sie die Maschine auf 45 Zyklen ein.
   4. Überwachen Sie die Reaktion in Echtzeit über die Softwareschnittstelle des Systems und beobachten Sie die Amplifikationskurven für jede Probe.
   5. Fügen Sie eine Negativkontrolle ohne cDNA hinzu, um auf Kontamination zu prüfen. Wiederholen Sie den PCR-Lauf 3x für jede Probe, um die Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten.
3. Datenanalyse
   1. Verwenden Sie nach Abschluss der Zyklen die Software des Systems, um die Werte des Schwellenwertzyklus (Ct) zu analysieren. Exportieren Sie die Ct-Werte zur weiteren Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm.
   2. Berechnen Sie die relative Genexpression unter Verwendung der ^{2-ΔΔCt-Methode 25}, wobei die Daten auf die β-Aktin-Kontrolle normiert werden.

5. Immunhistochemie und genetische Analysen

1. Durchführung von Immunhistochemie an Gewebeschnitten, um die MLH1-Proteinexpression mit den Genexpressionsniveaus zu korrelieren.
   1. Bereiten Sie Gewebeobjektträger vor und tragen Sie Anti-MLH1-Antikörper auf.
   2. Verwenden Sie einen HRP-konjugierten Sekundärantikörper und ein DAB-Substratkit (3,3'-Diaminobenzidin). Entwickeln Sie Objektträger gemäß den Anweisungen des Kits und analysieren Sie diese mit einem Lichtmikroskop.
2. Durchführung von methylierungsspezifischen PCR- und Mikrosatelliten-Instabilitätstests zur Unterscheidung zwischen Lynch-Syndrom und sporadischem Darmkrebs.
   1. Verwende ein kommerzielles DNA-Extraktionskit. Befolgen Sie das Kit-Protokoll sowohl für Blut- als auch für Tumorgewebe.
   2. Behandeln Sie DNA mit einem Bisulfit-Umwandlungskit. Verwenden Sie methylierungsspezifische Primer, die für die MLH1-Promotorregion entwickelt wurden. Führen Sie die PCR gemäß dem Kit-Protokoll durch.
   3. Führen Sie eine Gelelektrophorese auf den PCR-Produkten durch, um den Methylierungsstatus zu visualisieren.
   4. Für die Prüfung der Mikrosatelliteninstabilität (MSI) Kapillarelektrophorese mit einem genetischen Analysator. Vergleichen Sie die Länge von Mikrosatelliten durch die Analyse von fluoreszenzmarkierten PCR-Produkten.

6. Statistische Analyse

1. Verwenden Sie kommerzielle statistische Analysesoftware für die Datenanalyse.
   1. Öffnen Sie die Software und erstellen Sie einen neuen Datensatz für Genexpressions- und demografische Daten.
   2. Geben Sie die relativen Genexpressionswerte und die entsprechenden demografischen Daten in den Datensatz ein.
   3. Verwenden Sie den Kolmogorov-Smirnov-Test, um die Datennormalität zu beurteilen.
      1. Wählen Sie im oberen Menü die Option Analysieren aus, wählen Sie Nichtparametrische Tests und dann Legacydialogfelder aus.
      2. Klicken Sie auf Kolmogorov-Smirnov-Test und geben Sie die Variable für die Genexpression ein. Führen Sie den Test aus, und interpretieren Sie die Ausgabe für die Signifikanz der Verteilungsnormalität.
   4. Durchführung von T-Tests zum Vergleich der MLH1-Genexpression zwischen Patienten- und Kontrollgruppen.
      1. Wählen Sie Analyze (Analysieren), dann Compare Means (Mittelwerte vergleichen) und dann Independent Samples T Test (T-Test mit unabhängigen Stichproben) aus.
      2. Weisen Sie die Gruppenzugehörigkeit (Patient oder Kontrolle) als Gruppierungsvariable und die Genexpression als Testvariable zu. Führen Sie den Test aus, und interpretieren Sie das zweiseitige Signifikanzniveau.
   5. Berechnen Sie Faltungsänderungen in der Genexpression unter Verwendung der ^{2-ΔΔCt-Methode 25}.

Ergebnisse

In dieser Studie wurden 36 Patienten mit Dickdarmkrebs auf die MLH1-Genexpression im peripheren Blut und ihre Beziehung zu Dickdarmkrebs untersucht. Die Analyse demografischer Variablen zeigte, dass 15 Patienten (41,6 %) Frauen und 21 Patienten (58,4 %) Männer waren. Das Durchschnittsalter der Patienten betrug 57,35 ± 4,22 Jahre, und die Altersspanne lag zwischen 26 und 87 Jahren. Der Body-Mass-Index (BMI) der Patienten zeigte, dass 14 Patienten (38,8 %) einen normalen BMI (18...

Diskussion

Diese Studie wurde mit dem Ziel durchgeführt, die Expression des MLH1-Gens zu untersuchen. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die MLH1-Genexpression bei kranken Menschen im Vergleich zu gesunden Menschen verringert war. Basierend auf Studien zur Faltenveränderung konnte gezeigt werden, dass die Expression des MLH1-Gens im Stadium II, III und IV bei kranken Menschen im Vergleich zu gesunden Menschen signifikant abnahm.

Dar...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose Gel Electrophoresis Equipment	Bio-Rad	Mini-Sub Cell GT Systems	Used to check RNA quality
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884	Used as an anticoagulant for blood samples
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to determine RNA purity
Real-time PCR Machine	Applied Biosystems	A34322	Used for RT-PCR reactions
RNA Extraction Kit	Intron Biotechnology Co	#Cat 17061	Used for RNA extraction from blood samples
SYBR Green PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	4309155	Reagents used for RT-PCR experiments