Epithelzellinfektionsanalysen mit Shigellen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt Infektionsassays zur Abfrage der Shigella-Adhärenz, -Invasion und -intrazellulären Replikation unter Verwendung von In-vitro-Epithelzelllinien.

Zusammenfassung

Der an den Menschen angepasste bakterielle Erreger Shigella verursacht jedes Jahr Millionen von Infektionen, erzeugt langfristige Wachstumseffekte bei pädiatrischen Patienten und ist weltweit eine der Hauptursachen für Durchfalltode. Eine Infektion führt zu wässrigem oder blutigem Durchfall, da der Erreger den Magen-Darm-Trakt durchquert und die Epithelzellen infiziert, die den Dickdarm auskleiden. Angesichts der erschütternden Zunahme von Antibiotikaresistenzen und des derzeitigen Mangels an zugelassenen Impfstoffen sind standardisierte Forschungsprotokolle für die Untersuchung dieses gewaltigen Erregers von entscheidender Bedeutung. Hier werden Methoden vorgestellt, um die molekulare Pathogenese von Shigella anhand von In-vitro-Analysen der bakteriellen Adhärenz, Invasion und intrazellulären Replikation in Dickdarmepithelzellen zu untersuchen. Vor Infektionsanalysen wurde der Virulenzphänotyp der Shigella-Kolonien durch die Aufnahme des Kongorotfarbstoffs auf Agarplatten verifiziert. Supplementierte Labormedien können auch während der Bakterienkultivierung in Betracht gezogen werden, um In-vivo-Bedingungen nachzuahmen. Bakterienzellen werden dann in einem standardisierten Protokoll verwendet, um Dickdarmepithelzellen in Gewebekulturplatten bei einer etablierten Infektionsvielfalt mit Anpassungen zur Analyse jedes Infektionsstadiums zu infizieren. Für Adhärenz-Assays werden Shigella-Zellen mit reduzierten Medienkonzentrationen inkubiert, um den bakteriellen Kontakt mit Epithelzellen zu fördern. Sowohl für Invasions- als auch für intrazelluläre Replikationsassays wird Gentamicin in verschiedenen Zeitintervallen angewendet, um extrazelluläre Bakterien zu eliminieren und die Beurteilung der Invasion und/oder die Quantifizierung intrazellulärer Replikationsraten zu ermöglichen. Alle Infektionsprotokolle zählen adhärente, eingedrungene und/oder intrazelluläre Bakterien auf, indem infizierte Epithelzelllysate seriell verdünnt und bakterielle koloniebildende Einheiten relativ zu den Infektionstitern auf Kongo-Rotagarplatten plattiert werden. Zusammen ermöglichen diese Protokolle eine unabhängige Charakterisierung und Vergleiche für jedes Stadium der Shigella-Infektion von Epithelzellen, um diesen Erreger erfolgreich zu untersuchen.

Einleitung

Durchfallerkrankungen, die durch bakterielle Krankheitserreger verursacht werden, sind eine erhebliche globale Gesundheitsbelastung. Im Jahr 2016 waren Durchfallerkrankungen weltweit für 1,3 Millionen Todesfälle verantwortlich und waren die vierthäufigste Todesursache bei Kindern unter fünf Jahren ^1,2. Der gramnegative, enterische bakterielle Erreger Shigella ist der Erreger der Shigellose, einer der Hauptursachen für Durchfalltodesfälle weltweit³. Shigellose verursacht jedes Jahr eine signifikante Morbidität und Mortalität bei Kindern aus Ländern mit niedrigem und mittlerem Ei....

Protokoll

1. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien

HINWEIS: Alle Volumina stimmen mit einem Assay mit zwei 6-Well-Platten überein.

1. TSB-Medium: 0,5 l deionisiertes (DI) Wasser zu 15 g Medium Tryptische Sojabrühe (TSB, siehe Materialtabelle) geben und autoklavieren. Bei Raumtemperatur lagern.
2. Gallensalzmedium (TSB + BS): Zur Herstellung von TSB mit 0,4 % (w/v) Gallensalzen werden 0,06 g Gallensalze (BS, siehe Materialtabelle) in 15 ml autoklaviertem TSB resuspendiert. Filtersterilisation mit einem 0,22 μm PES-Filter.
   HINWEIS: Die Gallensalze bestehen aus einer 1:1-Mischung ....

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von drei standardisierten Assays zur Untersuchung der Shigella-Adhärenz, Invasion und intrazellulären Replikation von Darmepithelzellen. Obwohl es sich bei diesen Methoden lediglich um modifizierte Versionen klassischer Gentamicin-Assays handelt, die zur Untersuchung der Invasion und intrazellulären Replikation verschiedener bakterieller Krankheitserreger in Wirtszellen verwendet werden 49,50,51, müssen bei der Untersuchung von

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PES filter	Millipore-Sigma	SCGP00525	Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes	Corning	352059	17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes	Corning	430829	50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates	Corning	3516	Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts	Sigma-Aldrich	B8756	1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye	Sigma-Aldrich	C6277	A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide	Invitrogen	C10283	To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10569-010	DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135	Heat-inactivated, sterile
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G3632	Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38	Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film	Bemis	PM999	Laboratory sealing film
Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	1x concentration; pH 7.4
Select agar	Invitrogen	30391023	A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks	Corning	430641U	Tissue culture flasks
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	A common non-ionic surfactant and emulsifier
Trypan blue stain	Invitrogen	T10282	A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB)	Sigma-Aldrich	T8907	Bacterial growth media