Ein Mausmodell der Hyperlipidämie-induzierten Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt einen detaillierten Ansatz zur Replikation eines Mausmodells der Hyperlipidämie-induzierten Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF) vor. Das Design kombiniert die Verabreichung des Adeno-assoziierten Virus 9-kardialen Troponin-T-Low-Density-Lipoprotein-Rezeptors (AAV9-cTnT-LDLR) und Poloxamer-407 (P-407).

Zusammenfassung

Die Pathophysiologie der Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF), die durch Lipotoxizität angetrieben wird, ist unvollständig verstanden. Angesichts des dringenden Bedarfs an Tiermodellen, die kardiometabolische HFpEF genau nachahmen, wurde ein Hyperlipidämie-induziertes Mausmodell durch Reverse Engineering von Phänotypen entwickelt, die bei HFpEF-Patienten beobachtet wurden. Ziel dieses Modells war es, HFpEF zu untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf dem Zusammenspiel zwischen Lipotoxizität und metabolischem Syndrom lag. Hyperlipidämie wurde bei Wildtyp-Mäusen (WT) auf einem 129J-Stammhintergrund durch zweiwöchentliche intraperitoneale Injektionen von Poloxamer-407 (P-407), einem Blockcopolymer, das die Lipoproteinlipase blockiert, in Kombination mit einer einzigen intravenösen Injektion des Adeno-assoziierten Virus 9-kardialen Troponin-T-Low-Density-Lipoproteinrezeptors (AAV9-cTnT-LDLR) induziert. Zwischen 4 und 8 Wochen nach der Behandlung wurden umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, darunter Echokardiographie, Blutdruckmessung, Ganzkörperplethysmographie, Echokardiographie (EKG)-Telemetrie, Aktivitätsradüberwachung (AWM) sowie biochemische und histologische Analysen. Die LDLR/P-407-Mäuse zeigten nach vier Wochen charakteristische Merkmale, darunter diastolische Dysfunktion, erhaltene Ejektionsfraktion und erhöhte linksventrikuläre Wanddicke. Bemerkenswert ist, dass der Blutdruck und die Nierenfunktion im normalen Bereich blieben. Darüber hinaus zeigten EKG und AWM Herzblockaden bzw. verminderte Aktivität. Die diastolische Funktion verschlechterte sich nach acht Wochen, begleitet von einem signifikanten Rückgang der Atemfrequenzen. Weitere Untersuchungen des Doppelbehandlungsmodells zeigten erhöhte Fibrose-, feuchte/trockene Lungenverhältnisse und Herzgewichts-/Körpergewichtsverhältnisse. Die LDLR/P-407-Mäuse zeigten Xanthelasmen, Aszites und kardiale Ischämie. Interessanterweise traten plötzliche Todesfälle zwischen 6 und 12 Wochen nach der Behandlung auf. Das murine HFpEF-Modell bietet eine wertvolle und vielversprechende experimentelle Ressource zur Aufklärung der Feinheiten des metabolischen Syndroms, das zur diastolischen Dysfunktion im Kontext der Lipotoxizitäts-vermittelten HFpEF beiträgt.

Einleitung

Die Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF) bezeichnet ein kardiometabolisches Syndrom, das mit multiplen Komorbiditäten einhergeht und macht über 50% aller Fälle von Herzinsuffizienz^{aus 1,2}. Darüber hinaus ist die Häufigkeit von HFpEF in den letzten zehn Jahren stetig gestiegen³. Mit begrenzten Behandlungsmöglichkeiten stellt die HFpEF aufgrund ihrer facettenreichen Pathophysiologie den bedeutendsten ungedeckten medizinischen Bedarf bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen^{dar 4}. Daher besteht ein dringender Bedarf, die zugrunde liegenden Mechanismen und die Pathophysiologie der HFpEF besser zu verstehen, um wirksame Therapien zu entwickeln.

Trotz erheblicher Fortschritte in den letzten Jahren ist die Pathophysiologie der HFpEF, die auf Lipotoxizität zurückzuführen ist, nach wie vor unvollständig verstanden. Es wurde festgestellt, dass Patienten mit HFpEF im Vergleich zu Patienten mit Herzinsuffizienz mit reduzierter Ejektionsfraktion (HFrEF) und gesunden Kontrollen eine bemerkenswerte myokardiale Lipidakkumulation aufweisen⁵. RNA-Sequenzierungsdaten aus Herzbiopsien zeigten eine Herunterregulierung des Lipoproteinlipase-Gens (LPL) in der HFpEF-Gruppe im Vergleich zu gesunden und HFrEF-Patienten⁶. Poloxamer-407 (P-407) ist ein Blockcopolymer, das Hyperlipidämie induziert, indem es LPL blockiert und anschließend die Plasmatriglyceride und das LDL-Cholesterin (Low-Density-Lipoprotein)^{erhöht 7}. Frühere Studien zeigten eine hohe LDL-Rezeptor (LDLR)-Expression in den Herzen von HFpEF-Mäusen⁸.

Aufbauend auf diesen Erkenntnissen und in Anerkennung des dringenden Bedarfs an Tiermodellen, die die kardiometabolische HFpEF genau nachahmen, wurde ein Hyperlipidämie-induziertes Mausmodell entwickelt und vorgestellt. Dieses Modell wurde auf die Erforschung von HFpEF zugeschnitten und konzentrierte sich explizit auf die Beteiligung von Lipotoxizität neben dem metabolischen Syndrom. Induziert durch Hyperlipidämie/LPL-Blockade und erhöhte kardiale LDLR-Expression wurde dieses Modell bei WT-129-Mäusen auf 129J-Hintergrund durch zweiwöchentliche intraperitoneale (i.p.) Injektionen von P-407 in Kombination mit einer einzigen intravenösen (i.v.) Injektion des Adeno-assoziierten Virus 9-kardiales Troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)⁹ etabliert.

Zwischen 4 und 8 Wochen nach der Behandlung wurde eine umfangreiche Palette von Untersuchungen durchgeführt, die Echokardiographie, Blutdruckmessungen, Ganzkörperplethysmographie (WBP), kontinuierliche Elektrokardiographie (EKG)-Telemetrie, Aktivitätsradüberwachung (AWM) sowie biochemische und histologische Analysen^{umfassten 9}. Nach vier Wochen zeigten die LDLR/P407- oder "Doppelbehandlungs"-Mäuse deutliche HFpEF-Merkmale, einschließlich diastolischer Dysfunktion, erhaltener Ejektionsfraktion und erhöhter linksventrikulärer Wandstärke⁹. Darüber hinaus zeigten EKG-Telemetrie und AWM Herzblockaden bzw. verminderte Aktivität. Bemerkenswert ist, dass der Blutdruck und die Nierenfunktion normal blieben⁹. Nach acht Wochen verschlechterte sich die diastolische Funktion, und WBP-Messungen zeigten reduzierte Atemfrequenzen⁹.

Eine weitere Untersuchung des Doppelbehandlungsmodells ergab Fibrose, ein erhöhtes Verhältnis von nasser/trockener Lunge und ein Verhältnis von Herzgewicht zu Körpergewicht⁹. Die Autopsie ergab Aszites, kardiale Ischämie und Xanthelasmen. Interessanterweise wurden plötzliche Todesfälle zwischen 6 und 12 Wochen nach der Behandlung dokumentiert⁹. Dieses murine Hyperlipidämie-getriebene HFpEF-Modell bietet ein schnelles, wertvolles und vielversprechendes experimentelles Werkzeug, um die Komplexität des metabolischen Syndroms zu entschlüsseln, das zur diastolischen Dysfunktion mit Lipotoxizitäts-vermittelter HFpEF beiträgt.

Protokoll

Das Tierprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Universität von Miami genehmigt und entspricht den Richtlinien des National Institute of Health (NIH) (IACUC-Protokoll 23-103-AD03). Für die vorliegende Studie wurden Wildtyp-Mäuse (WT) mit 129J-Hintergrund aus einer kommerziellen Quelle erworben (siehe Materialtabelle) und intern gezüchtet. Alle Mäuse waren Wurfgeschwister auf 129J Hintergrund. Die Experimente umfassten sowohl männliche als auch weibliche Mäuse. Die LDLR/P-407 HFpEF-Maus wurde durch Verabreichung einer Einzeldosis AAV9-cTnT-LDLR in der ersten Woche und zweiwöchentlicher p407 über einen Zeitraum von vier Wochen etabliert.

1. AAV9-cTnT-LDLR Zubereitung und Verabreichung

HINWEIS: Das AAV9-cTNT-hLDLR-Plasmid (siehe Materialtabelle) kodiert für das vollständige humane LDLR-Protein (2664bp) (Abbildung 1).

1. Vorbereitung des AAV-LDLR-Virusvektors
   1. Basierend auf der Anzahl der Tiere werden die AAV9-Vorratsfläschchen 20 Minuten lang auf Eis aufgetaut und dann die AAV-Partikel in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) verdünnt, um eine Konzentration von 1 x 10¹² Vektorgenomen/Maus in 100 μl zu erhalten.
   2. Geben Sie die Viruslösung in eine 28-30 G-Nadel auf einer 1-ml-Spritze. Achte darauf, dass du keine Luftblasen in die Nadel ziehst.
2. Intravenöse (i.v.) Injektionsverfahren für die Schwanzvene
   1. Schalten Sie den Sauerstoff auf bis zu 0,5 l/min ein und stellen Sie das Isofluran-Anästhesiesystem auf 4%-5% ein. Legen Sie die Maus für ~2 Minuten in die Induktionskammer, bis das Tier nicht mehr ansprechbar ist.
   2. Setzen Sie das Tier auf einen Mausschwanz-Illuminator (z. B. Braintree Scientific, Inc. (Braintree, MA)) und legen Sie das Tier auf die Seite. Verwenden Sie zur Aufrechterhaltung eine Isofluran-Anästhesie von 2%-3%.
      HINWEIS: Die Erwärmung durch das Rückhaltegerät führt zu einer Erweiterung der Schwanzvene der Maus und erleichtert somit die Injektion erheblich.
   3. Identifiziere die seitliche Schwanzvene. Reinigen Sie den Injektionsbereich mit einem Antiseptikum mit einem Mullkissen.
   4. Halten Sie das Ende des Schwanzes fest, um ihn zu verlängern, und massieren Sie den Mausschwanz mit den Fingern, bis die Vene sichtbar ist. Führen Sie die Nadel in einem niedrigen Winkel (10-15 Grad Winkel) ein und injizieren Sie 100 μl verdünntes AAV in die Schwanzvene (Abbildung 2A).
   5. Ziehen Sie die Nadel zurück und üben Sie sofort mit einem Finger Druck aus, bis die Blutung aufhört. Setzen Sie die Maus wieder in den ursprünglichen Käfig ein.

2. Vorbereitung und Verabreichung von P-407

1. Vorbereitung P-407
   1. Die Lösung wird hergestellt, indem das Mittel P-407 (siehe Materialtabelle) mit DPBS in einem Abzug auf eine Endkonzentration von 100 mg/ml verdünnt wird. Die Lösung wird über Nacht auf einem Rotator bei 4 °C gekühlt, um das Auflösen des P-407¹⁰ zu erleichtern.
2. Zweiwöchentliches intraperitoneales (i.p.) Injektionsverfahren
   1. Wiegen Sie jede Maus am ersten Tag der i.p. Injektionen. Berechnen Sie mit der Formel 1 g/kg die geeignete Dosis für jede Maus anhand des Gewichts und der Vorfüllspritzen.
   2. Unter einem Abzug halten Sie die Maus manuell mit nach unten geneigtem Kopf und Körper fest, um die inneren Organe kranial neu zu positionieren. Diese Technik vermeidet die Punktion lebenswichtiger Strukturen in der Nähe.
   3. Identifizieren Sie die linke Peritonealhöhle im unteren Quadranten des Abdomens, lateral der Mittellinie. Reinigen Sie die Stelle mit einem Antiseptikum.
   4. Führen Sie die Nadel in einem Winkel von 45 Grad oder weniger in die Bauchhöhle ein (Abbildung 2B). Aspirieren Sie die Spritze, um eine ausreichende Insertion zu gewährleisten.
   5. Wenn bei der Aspiration Blut oder Gewebe vorhanden ist, ziehen Sie die Nadel zurück und wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 bis 2.2.4, bis die Spritze klar ist. Entsorgen Sie die Nadel in den entsprechenden Behälter für scharfe Gegenstände und setzen Sie die Maus wieder in den ursprünglichen Käfig ein.

3. Beurteilung der Echokardiographie

1. Präparat
   1. Tragen Sie am Tag vor der Bildgebung oder einige Stunden vor der Bildgebung Enthaarungscreme auf die Brust und den Oberbauch der Maus auf. Entfernen Sie die Creme mit feuchter Gaze nach 2 min.
   2. Betäuben Sie die Maus mit 2,5%-3,0% Isofluran bei einer Flussrate von 0,8 l/min und halten Sie sie mit 1%-1,5% Isofluran aufrecht. Befestigen Sie dann die Maus in Rückenlage mit den Pfoten auf Elektrodenpads mit leitfähigem Gel auf der entsprechenden Plattform und bedecken Sie Nase und Mund mit einem Nasenkonus, um eine kontinuierliche Anästhesie mit Isofluran zu gewährleisten.
2. Parasternale Längsachsenansicht
   1. Wenn die Maus in Rückenlage positioniert ist, neigen Sie die rechte Seite der Plattform um 45 Grad.
   2. Richten Sie als Nächstes die Wandlersonde diagonal im Schienensystem aus und schwenken Sie sie im Uhrzeigersinn um 30 bis 40 Grad von der rechten oberen Extremität zum linken Bauch, um Bilder im B-Modus zu erhalten und zu speichern.
   3. Analysieren Sie die B-Modus-Bilder mit einer Ultraschallanalysesoftware (siehe Materialtabelle), um die Ejektionsfraktion zu erhalten (Abbildung 3A).
3. Parasternale Kurzachsenansicht
   1. Drehen Sie die Wandlersonde im Schienensystem um 90 Grad im Uhrzeigersinn, um Bilder im B- und M-Modus zu erhalten und zu speichern.
4. Apikale Ansicht
   1. Kippen Sie die linke obere Ecke der Plattform nach unten und nach rechts. Richten Sie den Schallkopf auf die rechte Schulter des Tieres aus.
   2. Visualisieren Sie die Mitralklappe im B-Modus und im Farbdoppler-Modus. Erfassen und Speichern von gepulsten Wellendoppler- (PW) und Gewebedopplerbildern⁵.
   3. Analysieren Sie die PW-Doppler- und Gewebe-Doppler-Bilder mit der Ultraschallanalysesoftware, um IVRT, E/E' und E/A zu erhalten (Abbildung 3B-E).

4. Aufzeichnung der Druck-Volumen-Schleife (PV)

1. Führen Sie am Ende der Studie hämodynamische Analysen durch, um die systolische und diastolische Funktion des linken Ventrikels (LV) nach dem zuvor beschriebenen Verfahren^{zu beurteilen 11,12}.
   1. Beginnen Sie damit, die Maus mit Isofluran (3-5%, Induktionskammer) zu induzieren.
   2. Wenn die Anästhesiewirkung einsetzt, bringen Sie das Tier auf den Operationstisch und halten Sie die Anästhesie mit Isofluran (1-3%, Gesichtsmaske) aufrecht.
   3. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut über dem Hals, um eine endotracheale Intubation (durch den Mund) zu ermöglichen.
   4. Beatmung des Tieres mit einer Mischung aus Sauerstoff und Isofluran unter Verwendung eines Nagetierbeatmungsgeräts (z. B. Micro Vent Modell 848, Harvard-Gerät), das auf ein Volumen von ~0,15-0,2 ml und eine Atemfrequenz von 120-170 Atemzügen/min eingestellt ist.
   5. Überwachen Sie die Körpertemperatur während des gesamten Eingriffs auf einem temperaturgesteuerten Operationstisch bei ~37 °C ± 1 °C.
   6. Die linke Vena jugularis interna wird mit einer 30-G-Nadel freigelegt und kanüliert, um die Flüssigkeit unterstützend zu verabreichen.
   7. Schneiden Sie die Haut an der Stelle des Ventralhals medianus und legen Sie die Halsschlagader frei. Nach dem Verschluss des distalen Teils der rechten Halsschlagader ist ein kleiner Schnitt in der Arterie vorzunehmen, um das Einführen eines Mikro-Druckvolumenkatheters (PV) (siehe Materialtabelle) in den linken Ventrikel zu ermöglichen (geschlossener Thoraxzugang).
   8. Zeichnen Sie PV-Schleifen während des stationären Zustands und des Verschlusses der Vena cava inferior auf.
   9. Am Ende des Versuchs wird das Tier auf humane Weise (unter tiefer Betäubung) mit einer zugelassenen AVMA-Methode (z. B. Isofluran, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation) eingeschläfert.
   10. Analysieren Sie die PV-Daten mit der LabChart-Software (siehe Materialtabelle) und kalibrieren Sie die Volumina mit echokardiographischen Messungen.

Diskussion

Trotz des stetigen Anstiegs der Prävalenz von HFpEF in den letzten zehn Jahren ist ein konkretes Verständnis der zugrundeliegenden Pathophysiologie nach wie vor schwer fassbar¹³. Darüber hinaus gibt es bis heute nur eine begrenzte evidenzbasierte Therapie¹³. Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die an der kardiometabolischen HFpEF beteiligt sind, ist notwendig. Zuvor wurde ein hyperlipidämisches Mausmodell eingeführt, das HFpEF weder mit chronischer Nierenerkrankung (CKD) noch mit Bluthochdruck imitiert, der durch kardiale LDLR-OE- und p407-Injektionen induziert wird⁹.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Kombination von kardialer LDLR-OE und Hyperlipidämie nach vier Wochen zu diastolischer Dysfunktion, Herzrhythmusstörungen, linksventrikulärer (LV) Hypertrophie, Belastungsintoleranz, kardialer Lipidakkumulation und Fibrose bei Mäusen führt, wie zuvor veröffentlicht⁹. Bei diesen Mäusen wurde auch eine Erhöhung der LDL-Cholesterinaufnahme in den Herzen, der Leber und der Skelettmuskulatur sowie eine Verringerung der Triglyceride in Herz und Leber beobachtet⁹. Der Vorteil dieser Methode liegt in ihrer Schnelligkeit bei der Untersuchung der Signalwege des kardiometabolischen Syndroms, die im Vergleich zu anderen hyperlipidämischen HFpEF-Mausmodellen, wie z. B. der fettreichen Diät (HFD), die bis zu 16 und 20 Wochen benötigen, um¹⁴ zu entwickeln, nicht gut verstanden sind. Die Entwicklung dieses Modells dauert vier Wochen und ahmt metabolische Anomalien beim Menschen nach. Daher ist die Reproduzierbarkeit dieses Modells essentiell.

Es ist zwingend erforderlich, die gründliche Vorbereitung und Verabreichung von AAV9-cTnT-LDLR und P-407 sicherzustellen. Die Replizierbarkeit dieses Modells hängt stark von genauen Berechnungen der P-407- und AAV9-cTnT-LDLR-Konzentrationen und -Dosen sowie von Gewichtsmessungen ab. Ebenso wichtig sind Lösungsvorbereitungen und geeignete intravenöse und intraperitoneale Injektionstechniken. Abweichungen in diesen Techniken können zu erheblichen Veränderungen und unerwünschten Ergebnissen führen.

Trotz der Effektivität und Effizienz dieses Modells gibt es mehrere Einschränkungen. Für die Durchführung von intravenösen und intraperitonealen Injektionen ist eine strenge Schulung erforderlich. Darüber hinaus besteht ein potenzielles Morbiditäts- und Mortalitätsrisiko im Zusammenhang mit intravenösen und häufigen intraperitonealen Injektionen. Bei intravenösen Injektionen können Verletzungen des Mausschwanzes auftreten, während bei intraperitonealen Injektionen eine Zäkalpunktion auftreten kann, die zu einer Peritonitis führt¹⁵. Diese Verletzungen sind in der Regel auf falsche Techniken zurückzuführen und können zum Verlust von Versuchspersonen und Behandlungen führen. Daher ist vor der Durchführung dieser Verfahren eine umfangreiche Schulung erforderlich. Eine weitere Einschränkung ist die Fokussierung dieses Modells auf den Stamm 129J. Die Begründung für die Wahl des 129J-Stammes stammt aus Vorstudien, die bei diesem Stamm im Vergleich zu den C57BL/6-Mäusen, die wir ursprünglich in unveröffentlichten Untersuchungen untersucht hatten, zu schnelleren diastolischen Dysfunktionen und HFpEF-Ergebnissen führten.

Unabhängig von diesen Einschränkungen wird dieses Modell eine schnellere Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen der HFpEF und potenziell wirksamer Behandlungsoptionen ermöglichen. Frühere Studien haben zur Entwicklung eines pathophysiologischen Modells für kardiometabolische HFpEF-induzierte HFD und N[w]-Nitro-L-Argininmethylester (L-NAME) über 5-15 Wochen geführt¹³. Aufgrund des stetigen Anstiegs der Prävalenz von HFpEF besteht jedoch ein dringender Bedarf an weiterem Verständnis der Pathophysiologie der kardiometabolischen HFpEF und der Entwicklung einer wirksamen Therapie. Dieses Mausmodell der kardialen LDLR-OE und p407-induzierten Hyperlipidämie ist eine schnelle und praktikable Methode zur Induktion von kardiometabolischer HFpEF für zukünftige Forschungsvorhaben.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)	U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP)		Transgene plasmids and AAVs particles were generated by the U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP). AAV were provided in Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) with 0.001% Pluronic F68. The Core determined AAV titers by digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) and assessed all preparations for capsid protein ratio by SDS-PAGE and for the presence of endotoxin. Constructs include the human (h) transcripts tagged by 3X HA, Penn Vector Core (RRID: SCR_022432). AAV9-cTNT-hLDLR plasmid encodes the full human LDLR protein (2664bp).
Imaging systems with a high frequency transducer probe MS400	(VisualSonics, Toronto, ON, Canada)	Vevo 2100 or 3100
Isoflurane	Akorn Animal Health, Inc.	NDC: 59399-106-01
LabChart  software	ADInstruments	Pro version 8.1.5
Poloxamer 407	Sigma-Aldrich	16758
PV catheter	Millar Instrument	PVR 1035
Ultrasound analysis software	Vevo Lab
Wild-type (WT) mice on 129J background	Jackson Laboratory