Dissektion, histologische Verarbeitung und Genexpressionsanalyse von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe

Zusammenfassung

Hier bieten wir ein praktisches Verfahren zur Präparierung und Durchführung histologischer und Genexpressionsanalysen von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe.

Zusammenfassung

Die durch braunes Fettgewebe (BAT) vermittelte Thermogenese spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des Stoffwechsels, und ihre Morphologie und Funktion kann durch Umweltreize bei Mäusen und Menschen stark beeinflusst werden. Derzeit ist das murine interscapulare BAT (iBAT), das sich zwischen zwei Schulterblättern in der oberen Rückenflanke von Mäusen befindet, das wichtigste BAT-Depot, das von Forschungslabors zur Untersuchung der BAT-Funktion verwendet wird. Kürzlich wurden einige bisher unbekannte BAT-Depots bei Mäusen identifiziert, darunter eines, das dem menschlichen supraklavikulären braunen Fettgewebe entspricht. Im Gegensatz zu iBAT befindet sich das murine supraklavikuläre braune Fettgewebe (scBAT) in der Zwischenschicht des Halses und ist daher nicht so leicht zugänglich.

Um die Untersuchung neu identifizierter Maus-scBAT zu erleichtern, wird hierin ein Protokoll vorgestellt, das die Schritte zur Sezierung von intaktem scBAT von postnatalen und adulten Mäusen detailliert beschreibt. Aufgrund der geringen Größe von scBAT im Vergleich zu anderen Fettdepots wurden die Verfahren speziell für die Verarbeitung von scBAT modifiziert und optimiert. Zu diesen Modifikationen gehört der Einsatz eines Präpariermikroskops während der Gewebeentnahme, um die Präzision und Homogenisierung von gefrorenen scBAT-Proben zu erhöhen, um die Effizienz der nachfolgenden qPCR-Analyse zu erhöhen. Mit diesen Optimierungen können die Identifizierung, das morphologische Auftreten und die molekulare Charakterisierung des scBAT in Mäusen bestimmt werden.

Einleitung

Die zunehmende Prävalenz von Fettleibigkeit in den USA und weltweit hat ein großes Interesse am Verständnis ihrer Ätiologie und an der Identifizierung potenzieller Behandlungen geweckt ^1,2. Fettgewebe spielt eine wichtige Rolle im Stoffwechsel, und eine Fehlregulation des Fettgewebes kann zur Entwicklung von Fettleibigkeit führen. Im Allgemeinen gibt es zwei Arten von Fettgewebe, weißes und braunes Fettgewebe. Während weißes Fettgewebe (WAT) chemische Energie speichern und endokrine Faktoren absondern kann, kann braunes Fettgewebe (BAT) chemische Energie nutzen, um Wärme zu erzeugen und die Körpertemperatur in....

Protokoll

Die Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Baylor College of Medicine genehmigt. Alle Verfahren wurden an männlichen C57BL/6J-Mäusen im Alter von 3 Wochen und 3 Monaten durchgeführt. Vor der Sektion wurden alle Mäuse mit dem zugelassenen Kohlendioxid-Euthanasieverfahren von Nagetieren eingeschläfert. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Zerlegung von scBAT

1. Legen Sie den Mäusekadaver auf die Werkbank und reinigen Sie die chirurgische Schere und die superfeine Pinzette mit 70% Ethanol....

Diskussion

In diesem Protokoll stellen wir die Verfahren zur Dissektion und Verarbeitung von scBAT für H&E- und Genexpressionsanalysen detailliert vor. Da sich scBAT in der Zwischenschicht des Halses befindet und entlang der großen Venen liegt, erfordert die Isolierung dieses Depots eine präzise Technik. Um eine klare Sicht auf das Depot zu erhalten, empfehlen wir, die Maus nach dem Öffnen des Halses unter ein Präpariermikroskop zu legen. Verwenden Sie eine superfeine Pinzette, um scBAT von der Speicheldrüse und den umgebende.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95)	Epredia	8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100)	Epredia	8101
96-well PCR plate	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Binding Mini Column	Bio-Rad	7326826
Aurum High Stringency Wash	Bio-Rad	7326803
Aurum Low Stringency Wash	Bio-Rad	7326804
Base Molds (for embedding)	Tissue-Tek	4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL	Fisherbrand	02-681-453
Centrifuge	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument	Bio-Rad	12011319
Chloroform	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium	Epredia	83104
DEPC-Treated Water	Ambion	AM 9906
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ1500
DNase Dilution Solution	Bio-Rad	7326805
DNase I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	Invitrogen	18427013
Elution solution	Bio-Rad	7326801
EM 400 embedding medium paraffin	Leica Biosystems	3801320
Eosin Y (0.5% w/v)	RICCA	2858-16
Formula R Infiltration medium paraffin	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Embedding Cassettes	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL	Avantor	87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals)	Bio-Rad	MSB1001
Microtome	Leica Biosystems	RM2245
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CM
Mortar Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (for 0.85% saline)	Fisher Bioreagents	BP358-212
NanoDrop Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
Paraffin Section Flotation Bath	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
PCR Tube Strip	Avantor	76318-802
Pestle by Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Pestle Pellet Motor	Kimble	749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’			Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (surface decontaminant)	Thermo Scientific	1437535
RNase H	NEB	M0297S
Rnase inhibitor (RNase Out)	Invitrogen	10777019
Scintillation Vial (glass)	Electron Microscopy Sciences	72632
Slide drying bench	Electrothermal (Cole-Parmer)	MH6616
Stainless staining rack	Electron Microscopy Sciences	70312-54
Stereo microscope (for embedding)	Olympus	SZ51
Sugical scissors	McKesson	43-1-104
Superfine point Straight Dissecting Forceps	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT)	Invitrogen	18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL	Terumo	100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars)	Electron Microscopy Sciences	SKU: 62540-01
Toluene	Fisher Chemical	T324-1
Transfer pipette	Avantor	414004-005
Xylene	Fisher Chemical	X3P-1GAL