Kernisolierung aus kryokonservierten in vitro gewonnenen Blutzellen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Extraktion hochwertiger Zellkerne aus kryokonservierten induzierten pluripotenten Stammzelltypen, die aus Stroma-/Endothel- und Blutzelltypen gewonnen wurden, um Einzelkern-Sequenzierungsanalysen der nächsten Generation zu unterstützen. Die Herstellung hochwertiger, intakter Kerne ist für Multiomics-Experimente unerlässlich, kann aber für einige Labore ein Hindernis für den Einstieg in das Feld darstellen.

Zusammenfassung

Auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierende Modelle sind hervorragende Plattformen, um die Blutentwicklung zu verstehen, und iPSC-abgeleitete Blutzellen haben einen translationalen Nutzen als klinische Testreagenzien und transfusionierbare Zelltherapeutika. Das Aufkommen und die Erweiterung der Multiomics-Analyse, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNAseq) und den Assay für die Transposase-zugängliche Chromatin-Sequenzierung (snATACseq), bietet das Potenzial, unser Verständnis der Zellentwicklung zu revolutionieren. Dazu gehört auch die Entwicklungsbiologie mit in vitro hämatopoetischen Modellen. Es kann jedoch eine technische Herausforderung darstellen, intakte Zellkerne aus kultivierten oder primären Zellen zu isolieren. Unterschiedliche Zelltypen erfordern oft maßgeschneiderte nukleare Präparate, abhängig von der zellulären Steifigkeit und dem Gehalt. Diese technischen Schwierigkeiten können die Datenqualität einschränken und ein Hindernis für Forscher darstellen, die an Multiomics-Studien interessiert sind. Die Kryokonservierung von Proben ist oft aufgrund von Einschränkungen bei der Zellentnahme und/oder -verarbeitung erforderlich, und gefrorene Proben können zusätzliche technische Herausforderungen für die Isolierung intakter Kerne mit sich bringen. In diesem Manuskript stellen wir eine detaillierte Methode zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus iPSC-abgeleiteten Zellen in verschiedenen Stadien der hämatopoetischen In-vitro-Entwicklung für den Einsatz in Einzelkern-Multiomics-Arbeitsabläufen vor. Wir haben uns bei der Methodenentwicklung auf die Isolierung von Zellkernen aus iPSC-abgeleiteten adhärenten Stroma-/Endothelzellen und nicht-adhärenten hämatopoetischen Vorläuferzellen konzentriert, da diese in Bezug auf strukturelle und zelluläre Identität sehr unterschiedliche Zelltypen repräsentieren. Die beschriebenen Schritte zur Fehlerbehebung beschränkten die Verklumpung von Kernen und Trümmern und ermöglichten die Rückgewinnung von Kernen in ausreichender Menge und Qualität für nachgelagerte Analysen. Ähnliche Methoden können angepasst werden, um Zellkerne aus anderen kryokonservierten Zelltypen zu isolieren.

Einleitung

Die Hämatopoese ist ein relativ gut charakterisiertes Entwicklungssystem, aber die Unfähigkeit, die Blutzellbildung in vitro zu rekapitulieren, zeigt ein unvollständiges Verständnis der damit verbundenen Faktoren. Auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierende Hämatopoesemodelle können dazu beitragen, wichtige Entwicklungsfaktoren und die damit verbundene Biologie aufzuklären. Das iPSC-System bietet auch ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Bluterkrankungen, und iPSC-basierte Blutzellen wurden entwickelt, um translational und therapeutisch relevante Reagenzien herzustellen 1,2,3,4.

Protokoll

1. Kryokonservierung von Zellen

1. Frieren Sie >1 x 10 x 10^isolierte iPSC-abgeleitete Zellen pro ml in 1 ml 90 % FBS und 10 % DMSO ein. Geben Sie die Kryofläschchen in einen Gefrierbehälter bei -80 °C, um die Gefriergeschwindigkeit zu reduzieren und die Rückgewinnung lebensfähiger Zellen zu optimieren (Materialtabelle). Rechnen Sie mit erheblichen Zellverlusten, die je nach Kulturbedingungen und Zellidentität variieren können.
2. Wechsel von -80 °C zur Lagerung von flüssigem Stickstoff innerhalb von 24 h.

2. Auftauen der Zellen

1. Kryofläschchen aus dem....

Diskussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Die Isolierung hochwertiger Zellkerne ist essentiell für die erfolgreiche Implementierung derzeitiger, einzelkernbasierter Next-Generation-Sequencing-Modalitäten, die sich schnell weiterentwickeln. In Anbetracht der bestehenden Barrieren für Labore, die an diesen Ansätzen interessiert sind, insbesondere für kryokonservierte Proben, war es unsere Absicht, eine nukleare Isolationstechnik zu entwickeln, die auf zuvor gefrorene Zellen zugeschnitten ist. Die.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3