Kernisolierung aus kryokonservierten in vitro gewonnenen Blutzellen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Extraktion hochwertiger Zellkerne aus kryokonservierten induzierten pluripotenten Stammzelltypen, die aus Stroma-/Endothel- und Blutzelltypen gewonnen wurden, um Einzelkern-Sequenzierungsanalysen der nächsten Generation zu unterstützen. Die Herstellung hochwertiger, intakter Kerne ist für Multiomics-Experimente unerlässlich, kann aber für einige Labore ein Hindernis für den Einstieg in das Feld darstellen.

Zusammenfassung

Auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierende Modelle sind hervorragende Plattformen, um die Blutentwicklung zu verstehen, und iPSC-abgeleitete Blutzellen haben einen translationalen Nutzen als klinische Testreagenzien und transfusionierbare Zelltherapeutika. Das Aufkommen und die Erweiterung der Multiomics-Analyse, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNAseq) und den Assay für die Transposase-zugängliche Chromatin-Sequenzierung (snATACseq), bietet das Potenzial, unser Verständnis der Zellentwicklung zu revolutionieren. Dazu gehört auch die Entwicklungsbiologie mit in vitro hämatopoetischen Modellen. Es kann jedoch eine technische Herausforderung darstellen, intakte Zellkerne aus kultivierten oder primären Zellen zu isolieren. Unterschiedliche Zelltypen erfordern oft maßgeschneiderte nukleare Präparate, abhängig von der zellulären Steifigkeit und dem Gehalt. Diese technischen Schwierigkeiten können die Datenqualität einschränken und ein Hindernis für Forscher darstellen, die an Multiomics-Studien interessiert sind. Die Kryokonservierung von Proben ist oft aufgrund von Einschränkungen bei der Zellentnahme und/oder -verarbeitung erforderlich, und gefrorene Proben können zusätzliche technische Herausforderungen für die Isolierung intakter Kerne mit sich bringen. In diesem Manuskript stellen wir eine detaillierte Methode zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus iPSC-abgeleiteten Zellen in verschiedenen Stadien der hämatopoetischen In-vitro-Entwicklung für den Einsatz in Einzelkern-Multiomics-Arbeitsabläufen vor. Wir haben uns bei der Methodenentwicklung auf die Isolierung von Zellkernen aus iPSC-abgeleiteten adhärenten Stroma-/Endothelzellen und nicht-adhärenten hämatopoetischen Vorläuferzellen konzentriert, da diese in Bezug auf strukturelle und zelluläre Identität sehr unterschiedliche Zelltypen repräsentieren. Die beschriebenen Schritte zur Fehlerbehebung beschränkten die Verklumpung von Kernen und Trümmern und ermöglichten die Rückgewinnung von Kernen in ausreichender Menge und Qualität für nachgelagerte Analysen. Ähnliche Methoden können angepasst werden, um Zellkerne aus anderen kryokonservierten Zelltypen zu isolieren.

Einleitung

Die Hämatopoese ist ein relativ gut charakterisiertes Entwicklungssystem, aber die Unfähigkeit, die Blutzellbildung in vitro zu rekapitulieren, zeigt ein unvollständiges Verständnis der damit verbundenen Faktoren. Auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierende Hämatopoesemodelle können dazu beitragen, wichtige Entwicklungsfaktoren und die damit verbundene Biologie aufzuklären. Das iPSC-System bietet auch ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Bluterkrankungen, und iPSC-basierte Blutzellen wurden entwickelt, um translational und therapeutisch relevante Reagenzien herzustellen 1,2,3,4. Einzelzellstudien wurden ausgiebig eingesetzt, um die iPSC-basierte Entwicklungsbiologie zu untersuchen, einschließlich der Zelltypen, die während der Hämatopoese gebildet werden⁵. Im Vergleich zur Massen-RNA-Sequenzierung, bei der keine Beziehungen zwischen Zellsubpopulationen abgeleitet werden können⁶, ermöglichen Einzelzellmodalitäten die Beurteilung der Zellheterogenität und können die Identifizierung und Charakterisierung der Zellentwicklung erleichtern ^6,7.

Die Bildung hämatopoetischer Zellen aus iPSCs erfordert eine sequentielle Differenzierung durch primitive Streifen-, Mesoderm- und Endothelzustände, um hämogene Endothelzellen zu bilden. Hämogene Endothelzellen sind direkte Vorläufer von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen⁸. Diese Zelltypen haben bemerkenswert unterschiedliche morphologische und zelluläre Eigenschaften. Es gibt ein begrenztes Verständnis der epigenetischen Landschaft und der Entwicklungsdynamik von in vitro abgeleiteten hämatopoetischen Zellmodellen, obwohl dies ein wesentliches Wissen ist, um das volle therapeutische Potenzial des iPSC-Systems auszuschöpfen. In vielen Fällen ermöglichen nur Einzelzellanalysemodalitäten die Identifizierung von Zellpopulationen, transkriptionellen Aktivitäten, Chromatinlandschaften und Regulationsmechanismen, die die Entwicklung heterogener Zellpräparate steuern.

Zwei Methoden, die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNAseq) und die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNAseq), können transkriptionelle Erkenntnisse auf Einzelzellebene liefern⁹. Ein Hauptfaktor, der die Gültigkeit und Zuverlässigkeit der Daten bestimmt, ist der kompromisslose Bedarf an Proben, die strenge Qualitätskriterien erfüllen. Dazu gehören genaue Anforderungen an die Zell-/Kerndichte, optimale Viabilität und minimale Verklumpung. Die Präparation einzelner Zellkerne kann eine technische Herausforderung darstellen. Zusätzliche Herausforderungen können mit der Verwendung von zuvor kryokonservierten Zellen verbunden sein.

Wir weisen auf vier wichtige potenzielle Einschränkungen von Standard-scRNAseq-Ansätzen hin. Erstens beziehen sich Standardprotokolle zur Erzeugung von Zellsuspensionen oft auf Präparate aus frischen Zellen oder Geweben und nicht auf solche, die nach der Kryokonservierung gewonnen wurden¹⁰. Dies kann den Nutzen potenziell wertvoller Ressourcen einschränken. Zweitens ist die Dissoziationseffizienz verschiedener Zelltypen variabel. Zum Beispiel durchlaufen viele Immunzelltypen die Dissoziation relativ leicht. Im Gegensatz dazu haben Stromazellen, Fibroblasten und Endothelzellen, die normalerweise in die extrazelluläre Matrix und Basalmembran eingebettet sind, einzigartige Zelleigenschaften, die die Isolierung von Zellkernen erschweren können^11,12. Diese Eigenschaften können aggressive Dissoziationsprotokolle erforderlich machen, die die strukturelle Integrität empfindlicherer Zellpopulationen gefährden können. Drittens können einige Zellen (z. B. Megakaryozyten) einen Durchmesser von mehr als 100 μm erreichen und stellen Schwierigkeiten für mehrere bestehende kommerzielle Einzelzellplattformen dar¹³. Darüber hinaus kann eine unsachgemäße Handhabung zu zellulären Schäden und Stressreaktionen während der ersten Schritte der Zellisolierung führen, einschließlich enzymatischer Hydrolyse und mechanischer Dissoziation, was sich auf die Genexpressionsprofile auswirken kann^11,14.

Aus diesen und anderen Gründen kann ein Einzelkernansatz eine bevorzugte Alternative zu Einzelzellmethoden sein¹⁵. Aufgrund der überlegenen Stabilität der Kernmembran im Vergleich zur Zellmembran kann die Kernhülle auch nach der Kryokonservierung des Gewebes intakt bleiben¹⁶. Dies kann die Kernextraktion erleichtern und die Vielfalt der Probentypen erhöhen, die für Next-Generation-Sequencing-Modalitäten geeignet sind. Zweitens weisen die Zellkerne eine erhöhte Resistenz gegen mechanische Störungen auf und neigen dazu, während der Dissoziation weniger transkriptionelle Verschiebungen zu manifestieren¹⁴. Daher können Zellkerne eine höhere RNA-Stabilität und reproduzierbarere Transkriptionsprofile bieten. Ein dritter bemerkenswerter Vorteil von Einzelkernmethoden ist das Fehlen von Zellgrößenbeschränkungen und die Anwendbarkeit für größere Zellen wie Kardiomyozyten oder Megakaryozyten¹². Viertens dienen Zellkerne als geeignete Substrate für Multiomics-Analysen, die erweiterte Einblicke aus der integrierten Analyse der Genexpression, der zugänglichen Chromatinregionen und anderer Parameter¹⁷ bieten und ein tieferes Verständnis der Zellheterogenität, der Entwicklung und der Funktionszustände^{ermöglichen 18}.

Durch die Profilierung von iPSCs während der hämatopoetischen Entwicklung können Multiomics-Ansätze dazu beitragen, Entwicklungsprozesse in normalen oder pathologischen Krankheitsmodellen zu definieren. Vergleiche von iPSC-abgeleiteten Zellen mit primären Zellen oder Geweben können auch eine Bewertung der Treue des iPSC-Modells zur In-vivo-Biologie liefern, was die Verbesserung des iPSC-Modells und die Entdeckung neuer Zellpopulationen und Faktoren, die die Blutbildung vorantreiben, erleichtert.

Obwohl viele Gruppen die nukleare Isolierung und die daraus resultierende Sequenzierungsanalyse der nächsten Generation erfolgreich bewältigt haben, bleibt die Isolierung hochwertiger Kerne ein Hindernis für einige Laboratorien, die an der Durchführung von Einzelkernanalysen interessiert sind. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus zuvor kryokonservierten iPSC-abgeleiteten Zellen. Wir haben uns auf adhärente Stroma-/Endothelzellen und nicht-adhärente hämatopoetische Vorläuferzellen konzentriert, da diese in Struktur und Inhalt sehr unterschiedliche Zelltypen repräsentieren, die maßgeschneiderte Modifikationen und Fehlerbehebungen erfordern, um die Rückgewinnung hochwertiger Zellkerne zu verbessern, die für die Sequenzierung der nächsten Generation oder andere Experimente geeignet sind.

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Protokoll

1. Kryokonservierung von Zellen

1. Frieren Sie >1 x 10 x 10^isolierte iPSC-abgeleitete Zellen pro ml in 1 ml 90 % FBS und 10 % DMSO ein. Geben Sie die Kryofläschchen in einen Gefrierbehälter bei -80 °C, um die Gefriergeschwindigkeit zu reduzieren und die Rückgewinnung lebensfähiger Zellen zu optimieren (Materialtabelle). Rechnen Sie mit erheblichen Zellverlusten, die je nach Kulturbedingungen und Zellidentität variieren können.
2. Wechsel von -80 °C zur Lagerung von flüssigem Stickstoff innerhalb von 24 h.

2. Auftauen der Zellen

1. Kryofläschchen aus dem Flüssigstickstofflager entnehmen und 2 min in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Aus dem Wasserbad nehmen, solange noch kleine Eiskristalle sichtbar sind.
2. Übertragen Sie die Zellen aus dem Kryofläschchen in ein leeres 15-ml-Röhrchen und fügen Sie langsam 10 mL vorgewärmtes Medium (RPMI 1640 + 10 % FBS) hinzu, während Sie vorsichtig mischen. Zentrifugieren Sie bei 400 x g für 3 min bei 25 °C.
3. Der Überstand wird aspiriert und in 1 ml DPBS, ergänzt mit 2 % FBS und 1 mM CaCl₂ , rekonstituiert (Materialtabelle). Vorsichtig mischen, indem Sie 3x mit einer 1000 μL Mikropipette pipettieren. In ein 5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen umfüllen.

3. Entfernung abgestorbener Zellen

1. Geben Sie 50 μl Cocktail zur Entfernung toter Zellen (Tabelle der Materialien) zu 1 ml Zellsuspension. Geben Sie 50 μl Biotin Selection Cocktail in die Zellmischung. 3 min bei Raumtemperatur inkubieren. Diese Schritte markieren die in der Zellsuspension enthaltenen toten Zellen von Annexin V⁺ mit Biotin.
2. Die Dextran-Kügelchen wirbeln 30 s lang kräftig und sind für die Depletion unerwünschter Zelltypen konzipiert, die mit Biotin markiert sind (Table of Materials). Geben Sie 100 μl Dextrankügelchen in die Zellsuspension und mischen Sie, indem Sie 2x vorsichtig mit einer 1000 μl Mikropipette auf und ab pipettieren (Materialtabelle).
3. Geben Sie 1,3 mL DPBS mit 2 % FBS und 1 mM CaCl₂ in die Zellsuspension und mischen Sie, indem Sie 2x mit einer 1000-μl-Mikropipette vorsichtig auf und ab pipettieren. Setzen Sie das Röhrchen in den Magneten ein (Materialtabelle) und inkubieren Sie es 3 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Drehen Sie den Magneten und das Röhrchen um, um die angereicherte Lebendzellsuspension in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen zu gießen. Zentrifugieren Sie bei 400 x g für 3 min bei 4°C. Der größte Teil des Überstands wird entfernt und in 1 ml DPBS + 0,04 % BSA resuspendiert. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie 3x mit einer 1000-μl-Mikropipette pipettieren.

4. Isolierung der Zellkerne

1. Zentrifugieren Sie die Lebendzellsuspension bei 460 x g für 5 min bei 4 °C und aspirieren Sie dann den Überstand, um sicherzustellen, dass das Zellpellet nicht gestört wird.
2. Fügen Sie 100 μl frisch zubereiteten 0,5x Lysepuffer hinzu, der auf Eis gekühlt wurde (Tabelle 1), und mischen Sie vorsichtig, indem Sie 10x mit einer 100 μl Mikropipette pipettieren. 3 min auf Eis inkubieren.
3. Geben Sie 500 μl gekühlten Waschpuffer (Tabelle 2) in das Röhrchen, ohne zu mischen. Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.

5. Waschen und Beurteilung der Zellkerne

1. Überstand aspirieren und 500 μl gekühlten Waschpuffer hinzufügen, um das verbleibende intakte Pellet ohne Vermischung aufzulösen. Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den gesamten Überstand, ohne das Kernpellet zu zerstören.
2. In 120 μl gekühltem verdünntem Kernpuffer resuspendieren (Tabelle 3). Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einem 40-μm-Zellsieb (Materialtabelle).
3. Mit 0,4% Trypanblau färben und die Qualität der isolierten Zellkerne unter dem 10-fachen Mikroskop visuell beurteilen (Materialtabelle).

6. Verarbeitung isolierter Zellkerne

1. Halte die Kerne auf Eis. Fahren Sie sofort mit der weiteren Verarbeitung fort, da es im Laufe der Zeit zu nuklearen Verklumpungen kommen kann, die zusätzliche Filtrationsschritte erforderlich machen.

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Ergebnisse

Wir haben das oben erwähnte Protokoll verwendet, um Zellkerne aus kryokonservierten iPSC-abgeleiteten adhärenten Stroma-/Endothelzellen und nicht-adhärenten (schwebenden) hämatopoetischen Vorläuferzellen zu extrahieren. Eine detaillierte schematische Darstellung des Verfahrens der nuklearen Isolierung ist in Abbildung 1 zu finden.

Für die morphologische Untersuchung wurden isolierte Zellkerne mit Trypanblau gefärbt und unter dem Mikroskop sichtbar gemacht. ...

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Diskussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Die Isolierung hochwertiger Zellkerne ist essentiell für die erfolgreiche Implementierung derzeitiger, einzelkernbasierter Next-Generation-Sequencing-Modalitäten, die sich schnell weiterentwickeln. In Anbetracht der bestehenden Barrieren für Labore, die an diesen Ansätzen interessiert sind, insbesondere für kryokonservierte Proben, war es unsere Absicht, eine nukleare Isolationstechnik zu entwickeln, die auf zuvor gefrorene Zellen zugeschnitten ist. Die...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3