Bewertung der Konnektivitätsergebnisse von Ratten-Zwerchfell-Motoreinheiten als quantitative Biomarker für die Degeneration und Kompensation von phrenischen Motoneuronen

Zusammenfassung

In dieser Studie stellen wir eine in vivo Methode zur Schätzung der Anzahl und Größe der motorischen Einheiten vor, um die Konnektivität der Motoreinheiten der Rattenmembran zu quantifizieren. Es wird eine Schritt-für-Schritt-Herangehensweise an diese Techniken beschrieben.

Zusammenfassung

Der Verlust der Funktion der Beatmungsmuskulatur ist eine Folge von Motoneuronenverletzungen und Neurodegeneration (z. B. zervikale Rückenmarksverletzung bzw. amyotrophe Lateralsklerose). Phrenische Motoneuronen sind das letzte Bindeglied zwischen dem Zentralnervensystem und den Muskeln, und ihre jeweiligen motorischen Einheiten (Gruppen von Muskelfasern, die von einem einzigen Motoneuron innerviert werden) stellen die kleinste funktionelle Einheit des neuromuskulären Beatmungssystems dar. Das Compound Muscle Action Potential (CMAP), das Single Motor Unit Potential (SMUP) und die Schätzung der motorischen Einheitenzahl (MUNE) sind etablierte elektrophysiologische Ansätze, die die longitudinale Beurteilung der Integrität motorischer Einheiten in Tiermodellen im Laufe der Zeit ermöglichen, aber hauptsächlich auf die Gliedmaßenmuskulatur angewendet wurden. Daher besteht das Ziel dieser Studie darin, einen Ansatz in präklinischen Nagetierstudien zu beschreiben, der longitudinal verwendet werden kann, um die phrenische MUNE, die motorische Einheitengröße (dargestellt als SMUP) und CMAP zu quantifizieren, und dann den Nutzen dieser Ansätze in einem Motoneuronenverlustmodell zu demonstrieren. Sensitive, objektive und translational relevante Biomarker für neuronale Verletzungen, Degeneration und Regeneration bei Verletzungen und Erkrankungen von Motoneuronen können experimentelle Forschungsentdeckungen bis hin zu klinischen Tests erheblich unterstützen und beschleunigen.

Einleitung

Phrenische Motoneuronen (MNs), die sich von den Myotomspiegeln C3 bis C6 erstrecken, bilden das letzte Bindeglied vom Zentralnervensystem (ZNS) zum Zwerchfellmuskel¹. Phrenische motorische Einheiten (MUs) bestehen aus einer einzigen spinalen MN und ihren innervierten Zwerchfellmuskelfasern, die die kleinste funktionelle Einheit des respiratorischen neuromuskulären Systems bilden. Die Beatmungsfunktion erfordert eine adäquate Kontraktion des Zwerchfellmuskels, die durch eine koordinierte Aktivierung des phrenischen MU-Pools erreicht wird ^2,3. Viele neuro....

Protokoll

Alle Verfahren wurden genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Missouri durchgeführt. Die Experimente wurden an erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 11 bis 15 Wochen durchgeführt. Diese Ratten wurden paarweise untergebracht und in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 gehalten, wobei jederzeit Zugang zu handelsüblichem pelletiertem Futter und HCl-behandeltem Wasser zur Verfügung stand.

1. Vorbereitung der Tiere und Anästhesieverabreichung

1. Tragen Sie beim Umgang mit Ratten geeignete p....

Diskussion

Bei MN-degenerativen Erkrankungen wie ALS ist es entscheidend, die an der Beatmung beteiligten MUs zu beurteilen²⁸. Trotz des Auftretens von respiratorischer MN-Degeneration bei ALS-Patienten sind der spezifische Beginn und das Fortschreiten des MN-Todes nach wie vor unvollständig verstanden 29,30,31. In Anerkennung der Bedeutung dieses Aspekts wurden verschiedene Modell.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Glass Syringe	Kent Scientific Corporation	SOMNO-2ML
50 mL, Model 705 RN syringe	Hamilton Company	7637-01	Utilized to conduct intrapleural injection
5008 - Formulab Diet	LabDiet	0001325
Autoclavable 26 G needles (26S RN 9.52 mm 40°)	Hamilton Company	7804-04	Utilized to conduct intrapleural injection
Cholera toxin B-subunit (CTB)	MilliporeSigma	C9903	Utilized for intrapleural injection to label surviving motor neurons
Cholera toxin B-subunit conjugated to saporin (CTB-SAP)	Advanced Targeting Systems	IT-14	Utilized for intrapleural injection to cause motor neuron death
Detachable Cable	Technomed	202845-0000	to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine
Disposable 2" x 2" disc electrode with leads	Cadwell	302290-000	ground electrode
disposable monopolar needles 28 G	Technomed	202270-000	cathode and anode stimulating electrodes- recording electrodes
EMG needle cable (Amp/stim switch box)	Cadwell	190266-200	to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator
Helping Hands alligator clip with iron base	Radio Shack	64-079	Maintaining recording electrode placement
Isoflurane (250 mL bottle)	Piramal Healthcare
monoject curved tip irrigating syringe	Covidien	81412012	utilized for application of electrode gel
PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming	Kent Scientific Corporation	PS-RT	Includes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe
Pro trimmer Pet Grooming Kit	Oster	078577-010-003	clippers for hair removal
Saporin (SAP)	Advanced Targeting Systems	PR-01	Utilized for intrapleural injection (control agent when injected by itself)
Sierra Summit EMG system	Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA		portable electrodiagnostic system
SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SOMNO	Includes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter
Sprague-Dawley rat	Envigo colony 208a, Indianapolis, IN
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment	Puralube	26870	applied during anesthesia to avoid corneal injury