Bewertung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke in einem Mausmodell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

Zusammenfassung

Es wurde eine Methode entwickelt, um die Farbstoffextravasation aufgrund des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke (BHS) sichtbar zu machen, indem Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten zwei Fluoreszenzfarbstoffe verabreicht wurden. Die Verwendung von Glycerin als Kryoprotektivum erleichterte die Immunhistochemie an derselben Probe.

Zusammenfassung

Fluoreszierende Farbstoffe werden verwendet, um das Ausmaß der Farbstoffextravasation zu bestimmen, die aufgrund des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke (BHS) auftritt. Die Markierung mit diesen Farbstoffen ist ein komplexer Prozess, der von mehreren Faktoren beeinflusst wird, wie z. B. der Konzentration der Farbstoffe im Blut, der Durchlässigkeit der Hirngefäße, der Dauer der Farbstoffextravasation und der Verringerung der Farbstoffkonzentration im Gewebe aufgrund von Abbau und Diffusion. In einem Modell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma löst die Exposition gegenüber blasteninduzierten Schockwellen (BSWs) innerhalb eines begrenzten Zeitfensters einen BHS-Abbau aus. Um die genaue Abfolge des BHS-Abbaus zu bestimmen, wurden Evans-Blau und Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran intravaskulär und intrakardial in Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten relativ zur BSW-Exposition injiziert. Anschließend wurde die Verteilung der Farbstofffluoreszenz in Hirnschnitten aufgezeichnet. Unterschiede in der Verteilung und Intensität zwischen den beiden Farbstoffen zeigten die räumlich-zeitliche Abfolge des BHS-Abbaus. Die Immunfärbung der Hirnschnitte zeigte, dass astrozytäre und mikrogliale Reaktionen mit den Stellen des BHS-Abbaus korrelierten. Dieses Protokoll hat ein breites Potenzial für die Anwendung in Studien mit verschiedenen BHS-Abbaumodellen.

Einleitung

Der Abbau und die Funktionsstörung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) werden durch systemische Entzündungen, Infektionen, Autoimmunerkrankungen, Verletzungen und neurodegenerative Erkrankungen verursacht¹. Bei leichten traumatischen Hirnverletzungen (mTBI), die durch die Exposition gegenüber blastinduzierten Stoßwellen (BSWs) verursacht wurden, wurde eine signifikante Korrelation zwischen der Intensität von BSWs und der Menge des Fluoreszenzfarbstofflecks aufgrund des BHS-Abbaus^{beobachtet 2,3,4}. Ein bemerkenswertes Merkmal des BHS-Abbaus bei mSHT ist, dass er sofort oder innerhalb weniger Stunden nach der Exposition gegenüber BSWs beginnt und in der Regel ein vorübergehender Prozess ist, der etwa eine Woche andauert, bevor verzögerte, chronische neurologische Störungen auftreten 3,5,6,7. Obwohl die Details unklar bleiben, ist der BHS-Abbau Teil der lang anhaltenden pathologischen Kaskade und kann auch als prognostischer Faktor bei mTBI⁶ dienen. Daher ist es wichtig, die räumlichen und zeitlichen Verteilungen des BHS-Abbaus im Gehirn zu verstehen.

Fluoreszenzfarbstoffe werden verwendet, um das Ausmaß des BHS-Abbaus^{zu bestimmen 3,8}. Da sich die Blutkonzentration der Farbstoffe sowie das Ausmaß und das Ausmaß des BHS-Abbaus im Laufe der Zeit ändern, ist bei der Interpretation von Bildern der Farbstoffextravasation Vorsicht geboten. Zum Beispiel bedeutet das Fehlen einer Farbstoffextravasation nicht unbedingt das Fehlen eines BHS-Abbaus. Vor oder nach einem Anstieg der Blutkonzentration des Farbstoffs kann kein BHS-Abbau festgestellt werden. Selbst wenn sich der Farbstoff erfolgreich an der Stelle angesammelt hat, an der der BHS-Abbau stattfand, kann er im Laufe der Zeit verloren gegangen sein, nachdem der Abbau aufgehört hat. In der Regel werden wasserlösliche und biologisch inerte Substanzen schnell über den Urin ausgeschieden⁹. Um zu bestimmen, ob der BHS-Abbau zu einem bestimmten Zeitpunkt erfolgt, werden daher die zuverlässigsten Ergebnisse erzielt, wenn ein Fluoreszenzfarbstoff unmittelbar vor der Fixierung des Tieres für einen kurzen Zeitraum in den Blutkreislauf verabreicht wird. Auf diese Weise sollte kommerziell erhältliches Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Dextran mit einem spezifischen Molekulargewicht verwendet werden.

Evansblau ist ein weithin anerkannter blauer Azofarbstoff mit einer starken Affinität zu Serumalbumin. Der Farbstoff zeigt rote Fluoreszenz, wenn er in biologischen Systemen durch grünes Licht angeregt^{wird 2}. Aufgrund seiner inerten Natur verbleibt der Evans-Blauserum-Albumin-Komplex bis zu 2 h im Blut, was ihn zu einem nützlichen 69-kDa-Tracer für die Markierung von Regionen mit einer kompromittierten BHS für mindestens diese Dauer macht^10,11. Daher ist es wichtig, mögliche Unsicherheiten in Bezug auf die Pharmakokinetik und Toxizität von Evansblau⁹ zu berücksichtigen. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte jedoch, dass sich Evans-Blau weiterhin in Bereichen ansammelt, in denen die BHS nicht vorhanden oder gestört ist⁷. Diese Funktion ermöglichte es Evans Blue, die Historie des BHS-Abbaus aufzuzeichnen, während FITC-Dextran verwendet wurde, um den BHS-Abbau zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der BSW-Exposition aufzuzeichnen. Obwohl Evans Blue intravenös oder intraperitoneal verabreicht werden kann¹⁰, wird die intravenöse Verabreichung für zeitkritische Experimente bevorzugt. Ziel dieser Studie war es, die Verwendung von Evans-Blau und FITC-Dextran zur Detektion der räumlich-zeitlichen Verteilung des BHS-Abbaus nach BSW-Exposition zu demonstrieren.

Zweitens wurde in der Studie eine Technik zum Einfrieren von Hirnschnitten vorgestellt, nachdem die Fluoreszenz des BHS-Abbaus beobachtet und dünnere Schnitte hergestellt wurden, die für immunhistochemische Verfahren geeignet sind. Die Verwendung von Glycerin als Einbettmedium und Kryoprotektivum vereinfacht den immunhistochemischen Prozess. Durch den Vergleich von Bildern des BHS-Abbaus mit denen aus der Immunhistochemie kann die räumlich-zeitliche Verteilung des BHS-Abbaus mit der Gewebereaktion derselben Probe korreliert werden.

Protokoll

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien für Tierversuche durchgeführt, die vom National Defense Medical College (Tokorozawa, Japan) festgelegt wurden. Das Studienprotokoll wurde vom Committee for Animal Research am National Defense Medical College genehmigt (Zulassungsnummer 23011-1). In dieser Studie wurden männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 8 Wochen und einem Gewicht von 19-23 g verwendet. Wie in Abbildung 1 dargestellt, wurden eine einzelne Evans-Blue-Injektion und eine FITC-Dextran-Perfusion zu verschiedenen Zeitpunkten im Verhältnis zu einer einzigen BSW-Exposition durchgeführt. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Anästhesie

HINWEIS: Hierbei handelt es sich um ein modifiziertes Protokoll, das die Menge an Medetomidin im Vergleich zum ursprünglichen Protokoll um das 2,5-fache erhöht¹². Die Dosierungen für Medetomidinhydrochlorid, Midazolam und Butorphanol betrugen 0,75 mg/kg, 4 mg/kg bzw. 5 mg/kg.

1. Bereiten Sie eine Mischung aus Medetomidinhydrochlorid (75 μg/ml), Midazolam (400 μg/ml) und Butorphanol (500 μg/ml) in physiologischer Kochsalzlösung vor.
2. Verabreichen Sie die Mischung intraperitoneal, um die Maus zu betäuben (10 μl/g)¹³.
3. Überprüfen Sie nach ca. 5-10 Minuten eine ausreichende Anästhesie, indem Sie das Fehlen von Schwanzklemm- und Pedalrückzugsreflexen beobachten.
4. Halten Sie die Maus warm, bis sie sich von den Auswirkungen der Anästhesie erholt hat.

2. BSW-Exposition

HINWEIS: In dieser Studie wurde ein hauseigenes Stoßdämpferrohr verwendet¹⁴.

1. Betäuben Sie die Maus wie in Schritt 1 beschrieben.
2. Positionieren Sie die Maus 5 cm vom Auslassende des Stoßdämpfers entfernt und stellen Sie sicher, dass die Körperachse parallel zur Achse des Stoßdämpfers, aber nicht mit ihr ausgerichtet ist.
3. Geben Sie eine einzige BSW-Belichtung mit einem Spitzenüberdruck von 25 kPa an den Kopf ab.
   HINWEIS: Halten Sie die Maus warm, bis sie sich von den Auswirkungen der Anästhesie erholt hat. Überwachen Sie regelmäßig den Zustand der behandelten Maus. Wenn Anzeichen von Stress wie Schwierigkeiten beim Füttern oder Trinken, Buckeln oder anhaltendes abnormales Erscheinungsbild ohne Anzeichen einer Genesung beobachtet werden, euthanasieren Sie die Maus und beenden Sie den Versuch vorzeitig. Vermeiden Sie die Verabreichung von Analgetika, da diese möglicherweise die Reaktion der Gliazellen beeinträchtigen können.

3. Evans-Blau-Injektion in die Schwanzvene

HINWEIS: Die Evans Blue Lösung sollte intravenös ohne Anästhesie verabreicht werden. In Gegenwart einer Anästhesie dringt der Farbstoff oft nicht ausreichend in den Körper ein, wahrscheinlich aufgrund eines verringerten Blutdrucks und einer verringerten Körpertemperatur¹³. Evansblau wurde in einer Dosis von 100 mg/kg verabreicht.

1. Bereiten Sie die Evans-Blau-Lösung (4 % w/v in Kochsalzlösung) in einem Mikroröhrchen vor, wirbeln Sie sie dann vor der Verwendung vor und lagern Sie sie im Dunkeln.
2. Injizieren Sie die Lösung in die Schwanzvene (2,5 μl/g)¹³.

4. Transkardiale Perfusion mit FITC-Dextran-Lösung und Fixierung

1. Fügen Sie Heparin zu phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu, um eine Konzentration von 1 U/ml zu erhalten, und fügen Sie dann FITC-Dextran zu der heparinisierten PBS hinzu, um eine Konzentration von 3 mg/ml zu erreichen.
2. Lösen Sie das FITC-Dextran-Pulver vor Gebrauch vollständig auf. Schütteln Sie dazu die Lösung vorsichtig für 30 Minuten oder länger. Vor Gebrauch sorgfältig auf ungelöstes FITC-Dextran-Pulver prüfen. Falls noch etwas übrig ist, schütteln Sie es weiter, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
3. Betäuben Sie die Maus wie in Schritt 1 beschrieben.
4. Es wird mit dem Standardprotokoll der Perfusionsfixation unter Verwendung einer Peristaltikpumpe^{fortgefahren 15,16}. Zuerst perfundierte mit heparinisiertem PBS, das FITC-Dextran enthält, für 2 min mit einer Rate von 4,0 mL/min. Dann perfundieren Sie 2 min lang mit 10 % Formalin-Neutralpufferlösung oder 4 % Paraformaldehyd-PBS bei einer Geschwindigkeit von 4,0 ml/min, gefolgt von 8 min bei einer Geschwindigkeit von 3,5 mL/min.
5. Entfernen Sie das Gehirn vorsichtig mit einer chirurgischen Schere und Pinzette ^15,16. Nach der Dissektion wird das Gehirn über Nacht in demselben Fixiermittel (d. h. 10 % Formalin-Neutralpufferlösung oder 4 % Paraformaldehyd-PBS) bei 4 °C nachfixiert.
6. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Fixiermittel durch PBS.

5. Verarbeitung von Hirngewebe

HINWEIS: Auch wenn die Perfusionsfixierung abgeschlossen ist, können sich Evansblau und FITC-Dextran im Puffer dispergieren. Daher sollten die Eingriffe, die zu Schritt 6.8 führen, innerhalb einer Woche nach der Perfusionsfixation abgeschlossen sein. Vermeiden Sie außerdem, die Probe Licht auszusetzen.

1. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 500 μl 20 % Glycerin in Phosphatpuffer (PB; pH 7,4) in jeder Vertiefung vor.
2. Schneiden Sie das Gehirn mit einem Hirnschneider koronal in 12 Scheiben von je 1 mm Dicke.
3. Jede Scheibe in die entsprechende Vertiefung der 24-Well-Platte umfüllen und mindestens 2 h bei 4 °C lagern.
4. Ersetzen Sie die Lösung durch 50% Glycerin-PB und lagern Sie sie mindestens 2 h bei 4 °C.
5. Ersetzen Sie zum Schluss die Lösung durch 100% Glycerin. Für eine unmittelbare mikroskopische Betrachtung lassen Sie die Scheiben mindestens 2 h bei Raumtemperatur stehen oder lagern Sie sie bei 4 °C. Die Scheiben sind nun durchscheinend und bereit für die mikroskopische Betrachtung.

6. Fluoreszenzmessung der Farbstoffextravasation

HINWEIS: Die Effizienz der Fluoreszenzmarkierung variiert von Maus zu Maus. Daher muss die Fluoreszenzintensität normalisiert werden. Die Fluoreszenzwerte werden relativ zu denen innerhalb des gigantozellulären retikulären Kerns (GRN) exprimiert, da dieser Bereich durch die BSW-Behandlung nur minimal beeinflusst wird.

1. Geben Sie 500 μl Glycerin auf den Boden einer 35-mm-Glasbodenschale.
2. Übertragen Sie die Scheibe in die Glycerinlösung und bedecken Sie die Oberfläche mit einem Deckglas.
3. Entfernen Sie überschüssiges Glycerin vom Rand des Deckglases.
4. Messen Sie die Fluoreszenzintensität der Scheibe unter einem Fluoreszenzmikroskop.
5. Nach der mikroskopischen Messung legen Sie die Scheibe wieder in die Vertiefung.
6. Wiederholen Sie die Messung für alle 12 Scheiben.
7. Geben Sie 500 μl PB in jede Vertiefung und lagern Sie die 24-Well-Platte über Nacht bei 4 °C. Am nächsten Tag werden die Scheiben mit 50% Glycerin-PB gesättigt.
8. Ersetzen Sie die Lösung durch 30% Glycerin-PB und lagern Sie sie mindestens 2 h bei 4 °C.
9. Führen Sie die Verfahren in Schritt 7 innerhalb weniger Wochen durch.

7. Kryosektion und Immunhistochemie

1. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte vor, indem Sie 1000 μl einer Mischung aus gleichen Volumina Gewebegefriermedium und 30 % Glycerin-PB in Vertiefung 1 geben. Geben Sie dann 1000 μl Gewebegefriermedium in Vertiefung 2.
2. Die Scheibe auf Vertiefung 1 geben und die Platte bei 4 °C 1 h lang schütteln.
3. Die Scheibe auf Vertiefung 2 geben und die Platte bei 4 °C 1 h lang schütteln.
4. Frieren Sie die Scheibe schnell mit Isopentan mit Trockeneis ein, wobei Sie darauf achten müssen, dass sich die Scheibe nicht verbiegt. Lagern Sie die Scheiben bis zur Kryosektion bei -80 °C.
5. Kryosektion der Scheibe auf eine Dicke von 6 μm. Nach dem Trocknen auf dem Objektträger lagern Sie die Schnitte bei -80 °C.
6. Für die Antigengewinnung¹⁷ werden die Schnitte in 10 mM Natriumcitrat (pH 6,0) getaucht, einmal auf 100 °C erhitzt und dann 1 h lang bei 98 °C gehalten.
7. Waschen Sie die Abschnitte ausgiebig in destilliertem Wasser. Die Schnitte sind nun bereit für die immunhistochemische Färbung.

Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt den zeitlichen Verlauf der Farbstoffinjektion in Bezug auf das Einsetzen von BSW mit einem Spitzenüberdruck von 25 kPa. Im "Post"-Protokoll wurde die Evans-Blue-Lösung intravaskulär 2 h vor der FITC-Dextran-Perfusion verabreicht, die 6 h, 1 Tag, 3 Tage und 7 Tage nach der BSW-Exposition durchgeführt wurde. Im "Pre"-Protokoll wurde die Evans-Blue-Lösung unmittelbar vor der BSW-Exposition injiziert. Im "Post"-Protokoll wird erwartet, da...

Diskussion

Eine neuartige Doppelmarkierungstechnik mit Evans-Blau und FITC-Dextran wurde verwendet, um die genaue räumlich-zeitliche Verteilung des BHS-Abbaus in einem einzelnen Gehirn genau zu visualisieren. Im BSW-Modell mit niedriger Intensität wurden in den untersuchten Gehirnen deutliche Variationen in Ausmaß, Ort und Grad der Farbstoffextravasation beobachtet (Abbildung 2 und Abbildung 3). Die Fehlanpassungen zwischen den Farbstof...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Neutral Buffer Solution	FUJIFILM Wako Chemicals	062-01661
Anti GFAP, Rabbit	DAKO-Agilent	IR524
Anti Iba1, Rabbit	FUJIFILM Wako Chemicals	019-19741
Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21200
Cryo Mount	Muto Pure Chemicals	33351	tissue freezing medium
Domitor	Orion Corporation		medetomidine
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10040
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129
Falcon 24-well Polystyrene Clear Flat Bottom Not Treated Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile, 50/Case	CORNING	351147
Fluorescein isothiocyanate–dextran average mol wt 40,000	Sigma-Aldrich	FD40S	FITC-dextran
Glass Base Dish 27mm (No.1 Glass)	AGC TECHNO GLASS	3910-035	35 mm glass bottom dish
IX83 Inverted Microscope	OLYMPUS
MAS Hydrophilic Adhesion Microscope Slides	Matsunami Glass	MAS-04
Matsunami Cover Glass (No.1) 18 x 18mm	Matsunami Glass	C018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]	Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DAC	Merck Millipore	1.04005.1000
Peristaltic Pump	ATTO	SJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX Adult Mouse, 30 g, Coronal	ASI INSTRUMENTS	RBM-2000C	brain slicer
Vetorphale	Meiji Animal Health	VETLI5	butorphanol