Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese bei Drosophila

Zusammenfassung

Dieser Artikel nimmt die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellt ein optimiertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen vor, ein entscheidender Schritt für die Entstehung transgener Fliegen.

Zusammenfassung

Die Transgenese in Drosophila ist ein wesentlicher Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion auf der Ebene des Organismus. Die Mikroinjektion von Embryonen ist ein entscheidender Schritt für die Konstruktion transgener Fliegen. Für die Mikroinjektion sind einige Arten von Geräten erforderlich, darunter ein Mikroinjektor, ein Mikromanipulator, ein inverses Mikroskop und ein Stereomikroskop. Plasmide, die mit einem Plasmid-Miniprep-Kit isoliert wurden, sind für die Mikroinjektion qualifiziert. Embryonen im Prä-Blastoderm- oder Synzytial-Blastoderm-Stadium, bei denen sich die Zellkerne ein gemeinsames Zytoplasma teilen, werden einer Mikroinjektion unterzogen. Ein Zellsieb erleichtert den Prozess der Dechorionisierung von Embryonen. Der optimale Zeitpunkt für die Dechorionierung und Austrocknung von Embryonen muss experimentell bestimmt werden. Um die Effizienz der Mikroinjektion von Embryonen zu erhöhen, müssen die mit einem Abzieher vorbereiteten Nadeln mit einem Nadelschleifer abgeschrägt werden. Beim Schleifen von Nadeln verwenden wir eine Fußluftpumpe mit Manometer, um die Kapillarwirkung der Nadelspitze zu vermeiden. Wir injizieren routinemäßig 120-140 Embryonen für jedes Plasmid und erhalten mindestens eine transgene Linie für etwa 85% der Plasmide. Dieser Artikel nimmt die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellt ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese in Drosophila vor.

Einleitung

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist äußerst empfänglich für genetische Manipulationen und genetische Analysen. Transgene Fruchtfliegen sind in der biologischen Forschung weit verbreitet. Seit ihrer Entwicklung in den frühen 1980er Jahren ist die P-Element-Transposon-vermittelte Transgenese für die Drosophila-Forschung unverzichtbar¹. In einigen Szenarien wurden auch andere Transposons wie piggyBac und Minos für die Transgenese in Drosophila verwendet². Transgene über Transposons werden zufällig in das Drosophila-Genom eingefügt, und die Expressionsniveaus von Transgenen an ver....

Protokoll

1. Herstellung von Plasmiden

1. Isolieren Sie Plasmide aus 4-ml-Bakterienkulturen über Nacht mit einem Plasmid-Miniprep-Kit. Eluieren Sie mit 40 μl Elutionspuffer.
   HINWEIS: Die Isolierung von Plasmiden mit einem Plasmid-Midi-Prep-Kit ist nicht erforderlich. Ein Plasmid-Miniprep-Kit kann die experimentellen Anforderungen für die Mikroinjektion von Embryonen vollständig erfüllen. In diesem Protokoll enthalten die präparierten UAS-cDNA/ORF-Plasmide zehn Kopien von UAS, einen Hsp70-Minimalpromotor, eine attB-Stelle, ein mini-weißes Gen und ein Gen von Interesse.
2. Bestimmen Sie die Plasmid-DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer u....

Diskussion

Hier stellen wir ein Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese bei Drosophila vor. Für die phiC31-vermittelte ortsspezifische Transgenese injizierten wir 120-140 Embryonen für jedes Plasmid und erhielten mindestens eine transgene Linie für etwa 85% der Plasmide (Ergänzende Tabelle 2). Unserer Erfahrung nach ist Plasmid-DNA, die mit einem Plasmid-Miniprep-Kit isoliert wurde, für die Transgenese in Drosophila ausreichend. Plasmid-DNA-Konzentrationen von 20 ng/μ.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Cell Strainer	NEST	258367
3M double-sided adhesive	3M	415
Borosilicate glass	SUTTER	B100-75-10
Diamond abrasive plate	SUTTER	104E
FLAMING/BROWN Micropipette Puller	SUTTER	P-1000
Foot air pump with pressure gauge	Shenfeng	SF8705D
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2R
Microinjection pump	eppendorf	FemtoJet 4i
Micromanipulator	eppendorf	TransferMan 4r
Micropipette Beveler	SUTTER	BV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)	CITOLAS	10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)	CITOLAS	188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)	LAIBOER	4190152
Photo-Flo 200	Kodak	1026269
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745