Live-Bildgebung zur Quantifizierung der zellulären Strahlenempfindlichkeit in patienteneigenen Tumororganoiden

Zusammenfassung

Im Folgenden stellen wir einen einfachen Live-Imaging-Ansatz zur Quantifizierung der Empfindlichkeit von patienteneigenen Tumororganoiden gegenüber ionisierender Strahlung vor.

Zusammenfassung

Die Strahlentherapie (RT) ist eine der tragenden Säulen des modernen klinischen Krebsmanagements. Allerdings sind nicht alle Krebsarten gleich empfindlich gegenüber Strahlung, oft (aber nicht immer) aufgrund von Unterschieden in der Fähigkeit bösartiger Zellen, oxidative DNA-Schäden zu reparieren, die durch ionisierende Strahlen hervorgerufen werden. Klonogene Assays werden seit Jahrzehnten eingesetzt, um die Empfindlichkeit von kultivierten Krebszellen gegenüber ionisierender Bestrahlung zu beurteilen, vor allem, weil bestrahlte Krebszellen oft verzögert sterben, was mit kurzfristigen Durchflusszytometrie- oder mikroskopiegestützten Techniken schwer zu quantifizieren ist. Leider können klonogene Assays als solche nicht für komplexere Tumormodelle, wie z. B. patientenabgeleitete Tumororganoide (PDTOs), eingesetzt werden. In der Tat kann die Bestrahlung etablierter PDTOs ihr Wachstum als mehrzellige Einheiten nicht unbedingt aufheben, es sei denn, ihr stammartiges Kompartiment wird vollständig beseitigt. Darüber hinaus kann die Bestrahlung von PDTO-abgeleiteten Einzelzellsuspensionen die Empfindlichkeit maligner Zellen gegenüber RT im Kontext etablierter PDTOs möglicherweise nicht richtig rekapitulieren. In diesem Artikel beschreiben wir eine Adaption konventioneller klonogener Assays, bei der etablierte PDTOs ionisierender Strahlung ausgesetzt werden, gefolgt von Einzelzelldissoziation, Replattierung unter geeigneten Kulturbedingungen und Live-Bildgebung. Nicht bestrahlte (Kontroll-)PDTO-abgeleitete stammähnliche Zellen reformieren wachsende PDTOs mit einer PDTO-spezifischen Effizienz, die durch Bestrahlung dosisabhängig negativ beeinflusst wird. Unter diesen Bedingungen können die Effizienz und Wachstumsrate der PDTO-Bildung als Maß für die Strahlenempfindlichkeit auf Zeitrafferbildern quantifiziert werden, die aufgenommen wurden, bis die Kontroll-PDTOs eine vordefinierte Raumbelegung erreichen.

Einleitung

Die externe Strahlentherapie (RT) ist eine der tragenden Säulen der modernen Onkologie und spiegelt nicht nur eine ausgeprägte Antikrebsaktivität wider, die mit einem klar definierten Spektrum allgemein beherrschbarer Nebenwirkungen einhergeht¹, sondern auch eine außergewöhnlich weit verbreitete klinische Verfügbarkeit (die meisten Krebszentren in den Industrieländern sind mit modernen Linearbeschleunigern für externe Strahlen-RT ausgestattet)². In Übereinstimmung mit dieser Vorstellung wird die RT weltweit mit Erfolg sowohl für kurative Zwecke, im Allgemeinen im Rahmen der Erkrankung im....

Protokoll

Die in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Organoid-Kultur

HINWEIS: TNBC#1 PDTOs wurden in unserem Labor auf der Grundlage von Tumorgewebe etabliert, das chirurgisch von einer Patientin mit dreifach negativem Brustkrebs (TNBC) entnommen wurde, die eine Einverständniserklärung zur Teilnahme an einem Biobanking-Protokoll gegeben hatte (IRB21-06023682). Nach Validierung durch Histologie und RNA-Sequenzierung (RNAseq) werden TNBC#1 PDTOs in 66% Matrigeltropfen (sogenannte "Domes") in angereichertem DM....

Diskussion

Hier beschreiben wir eine Adaption konventioneller klonogener Assays, die Brustkrebs-PDTOs und Live-Imaging nutzen, um die PDTO-Strahlenempfindlichkeit basierend auf (1) der Persistenz von PTDO-bildenden stammähnlichen Zellen nach PDTO-Bestrahlung in vitro und (2) der Wachstumsrate der PDTOs, die diese Zellen erzeugen (können), zu quantifizieren. Zu den kritischen Schritten dieses Protokolls gehören (1) die Etablierung von PDTOs für eine Kuppelbelegung, die eine gute Lebensf.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm mesh filter	Thomas Scientific	1164H35
B27	Invitrogen	17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter	Nexcelom
DMEM F/12	Corning	12634-010
Epidermal Growth Factor hEGF	Peprotech	AF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope	Thermo Fisher Scientific	12-563-460
FGF10	Peprotech	100-26
FGF7	Peprotech	100-19
GlutaMax	Invitrogen	35050061
Hepes	Invitrogen	15630-080
IncuCyte software 2021A	Sartorius		version: 2021A
Incucyte SX1	Sartorius		model SX1
Incucyte validated 48 well plate	Corning	3548
Matrigel	Discovery Labware	354230
nAc	Sigma Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plate	Cellstar	657 185
NR (Heregulin)	Peprotech	100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190	Sigma Aldrich	S7067
PBS	Corning	21-040-CV
PenStrep	Invitrogen	15140-122
Primocin	Invivogen	ant-pm-1
Rspondin Media			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP)	Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01	Tocris	2939
Trypan blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-61
TrypLE	Gibco	112605-028
Y-27632 (RhoKi)	Selleck	S1049