Generierung und funktionelle Verifizierung von Hypoxie-sensitiven chimären Antigenrezeptor-T-Zellen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung und funktionellen Verifizierung von Hypoxie-sensitiven chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen vor. Dieses Protokoll stellt die Lentivirus-basierte Generierung von Hypoxie-sensitiven CAR-T-Zellen und deren Charakterisierung vor, einschließlich der Validierung der Hypoxie-abhängigen CAR-Expression und der selektiven Zytotoxizität.

Zusammenfassung

Umfangreiche Studien haben das Versprechen der chimären Antigenrezeptor-T-ZELLTHERAPIE (CAR-T) bei der Behandlung hämatologischer Malignome bewiesen. Die Behandlung solider Tumore bleibt jedoch eine Herausforderung, wie die Sicherheitsbedenken zeigen, die entstehen, wenn CAR-T-Zellen normale Zellen angreifen, die die Zielantigene exprimieren. Forscher haben verschiedene Ansätze untersucht, um die Tumorselektivität der CAR-T-Zelltherapie zu verbessern. Eine repräsentative Strategie in diesem Sinne ist die Konstruktion von Hypoxie-sensitiven CAR-T-Zellen, die durch die Fusion einer sauerstoffabhängigen Abbaudomäne mit der CAR-Einheit konzipiert sind und so konzipiert sind, dass sie nur in einer hypoxischen Umgebung - der Tumormikroumgebung (TME) - eine hohe CAR-Expression erreichen. In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Erzeugung solcher CAR-T-Zellen und ihre funktionelle Charakterisierung vorgestellt, einschließlich Methoden zur Analyse der Veränderungen der CAR-Expression und der Abtötungskapazität als Reaktion auf unterschiedliche Sauerstoffgehalte, die von einer mobilen Inkubatorkammer festgelegt werden. Es wird erwartet, dass die konstruierten CAR-T-Zellen die CAR-Expression und Zytotoxizität auf sauerstoffempfindliche Weise nachweisen und damit ihre Fähigkeit unterstützen, zwischen hypoxischem TME und normoxischem Normalgewebe für eine selektive Aktivierung zu unterscheiden.

Einleitung

Die Therapie mit chimären Antigenrezeptor-T-Zellen (CAR-T) hat einen bedeutenden Durchbruch in der Krebsbehandlung dargestellt. Seit der Zulassung der ersten CAR-T-Therapie zur Behandlung von fortgeschrittenem/resistentem Lymphom und akuter lymphatischer Leukämie durch die Food and Drug Administration (FDA) im Jahr 2017 ^{1,2,3 1,2,3} haben 10 CAR-T-Therapien, die auf CD19 oder das B-Zell-Reifungsantigen (BCMA) abzielen, weltweit die Zulassung erhalten⁴. Trotz umfangreicher Forschung bleibt es jedoch....

Protokoll

In dieser Studie wurde HER2-BBz-ODD, ein Hypoxie-sensitives CAR, das auf HER2 abzielt (Gen-ID: 2064), mit seinem regulären Gegenstück HER2-BBz verglichen. Die Schaltpläne der beiden CARs sind in Abbildung 1A dargestellt, die zeigt, dass HER2-BBz-ODD von HER2-BBz abgeleitet wird, indem die ODD-Sequenz an den C-Terminus von CD3ξ angehängt wird. Die Konstruktion von lentiviralen Vektoren, die die beiden CARs exprimieren, und die Erzeugung des entsprechenden Lentivirus durch 293T-Zelltransfektion wurde bereits beschrieben³¹.

1. Erzeugung von Hypoxie-se....

Diskussion

Sicherheitsbedenken sind wichtige Aspekte, die angegangen werden müssen, damit eine CAR-T-Zelltherapie in den klinischen Einsatz übergehen kann. Die Nutzung der einzigartigen Eigenschaften von Tumorzellen oder der TME ist zu einer primären Forschungsrichtung geworden, die sich auf die Entwicklung von CAR-T-Zellen konzentriert, die selektiv auf Tumorgewebe abzielen. Das Design eines Hypoxie-sensitiven CAR-T ist eine attraktive Strategie in diese Richtung, wobei mehrere Ansätze untersu.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge tube	QSP	509-GRD-Q	Supernatants and cells cellection Protocol Step 2,3,4
10% ExpressCast PAGE	NCM biotech	P2012	Immunoblotting Protocol Step 3
10x PBS	NCM biotech	20220812	Cell culture Protocol Step 4
10 mL pipette	Yueyibio	YB-25H	Pipetting Protocol Step 1
10xTRIS-Glycine-SDS electrophoresis buffer	Epizyme	3673020	Immunoblotting Protocol Step 3
15 mL Centrifuge tube	Thermo Scientific	339650	Supernatants and cells cellection Protocol Step 1
25 cm2 EasYFlask	Thermo Scientific	156367	Cell culture Protocol Step 3,4
4x Protein SDS PAGE Loading Buffer	Takara	9173	Immunoblotting Protocol Step 3
6-well flat-bottom tissue culture plates	Thermo Scientific	140675	T Cells culture Protocol Step 1
96-well black flat-bottom tissue culture plates	Greiner	655090	Cytotoxicity assay Protocol Step 4
96-well ELISA plates	Corning	3590	ELISA Protocol Step 5
96-well plate shaker	QILINBEIER	MH-2	Shake Protocol Step 4
96-well U-bottom tissue culture plates	Thermo Scientific	268200	Supernatants cellection Protocol Step 4,5
anti-FLAG antibody	Sigma	F1804-50UG	Immunoblotting Protocol Step 3
Carbinol	Sinopharm	10010061	Immunoblotting Protocol Step 3
Carbon dioxide incubator	Thermo Scientific	360	Cell culture Protocol Step 1,2,3,4
Cell counting plate	Hausser scientific	1492	Cell counting Protocol Step 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG Kit	Thermo Scientific	11531D	Mouse IgG magnetic beads Protocol Step 1
Centrifuge	Thermo Scientific	75002432	Cell culture Protocol Step 1,3,4
Chemiluminescence gel imaging system	BIO-RAD	12003154	Immunoblotting Protocol Step 3
Cobalt chloride solution (0.5 M)	bioleaper	BR4000203	Hypoxic condition Protocol Step 2,3,4
DMEM	Corning	10-103-CV	Cell culture Protocol Step 4
Electronic balance	Sartorius	PRACTUM612-1CN	weigh Protocol Step 5
FBS	BI	04-001-1ACS	Cell culture Protocol Step 3,4
GAPDH Mouse mAb	ABclonal	AC002	Immunoblotting Protocol Step 3
Gel electrophoresis apparatus	BIO-RAD	1645070	Immunoblotting Protocol Step 3
GloMax Microplate Readers	Promega	GM3000	luciferase activity measurement Protocol Step 4
Goat anti-Mouse IgG (H+L)	Yeasen	P1126151	Immunoblotting Protocol Step 3
High speed microfreezing centrifuge	eppendorf	5810 R	Cell culture Protocol Step 1
Human IFN-γ ELISA Set	BD	555142	ELISA Protocol Step 5 Items: Recombinant Human IFN-γ Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IFN-γ , Capture Antibody Purified Anti-Human IFN-γ, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
Human IL-2 ELISA Set	BD	555190	ELISA Protocol Step 5 Items: Recombinant Human IL-2 Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IL-2 , Capture Antibody Purified Anti-Human IL-2, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
IL-15	R&D systems	P40933	T Cells culture Protocol Step 1
IL-21	Novoprotein	GMP-CC45	T Cells culture Protocol Step 1
IL-7	R&D systems	P13232	T Cells culture Protocol Step 1
Inverted microscope	Olympus	CKX41	Cell culture Protocol Step 1,3,4
Jurkat	ATCC	TIB-152	CAR-Jurkat construction Protocol Step 3
LSRFortessa	BD	LSRFortessa	Flow cytometry Protocol Step 2
Luciferase Assay System	Promega	E1501	luciferase reporter assay Protocol Step 4 Items: Passive lysis buffer, firefly luciferase substrate
Microplate reader	BioTek	HTX	ELISA Protocol Step 5
mobile CO2/O2/N2 Incubator Chamber	China Innovation Instrument Co., Ltd.	Smartor118	Hypoxic condition Protocol Step 2, 3, 4
Mouse Anti-Hexa Histidine tag	Sigma	SAB2702218	Immunoblotting Protocol Step 3
NcmBlot Rapid Transfer Buffer	NCM biotech	WB4600	Immunoblotting
NcmECL Ultra	NCM biotech	P10300	Immunoblotting Protocol Step 3 Items: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagent (A) ,NcmECL Ultra Stabilized Peroxide Reagent (B)
NovoNectin -coated 48-well flat plates	Novoprotein	GMP-CH38	CAR-T cells construction Protocol Step 1
OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) tablet set	Sigma	P9187	Substrate Reagent Protocol Step 5 Items: OPD tablet (silver foil),urea hydrogen peroxide tablet (gold foil)
PE-conjugated anti-DYKDDDDK	Biolegend	637310	Flow cytometry Protocol Step 2
Protamine sulfate	Sigma	P3369-1OG	Lentivirus infection Protocol Step 1
Protein Marker 10 Kda-250 KDa	Epizyme	WJ102	Immunoblotting Protocol Step 3
Purifed NA/LE Mouse Anti-Human CD3	BD	566685	T Cells culture Protocol Step 1
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28	BD	555725	T Cells culture Protocol Step 1
PVDF membrane	Millipore	168627	Immunoblotting Protocol Step 3
RPMI 1640	Corning	10-040-CVRC	Cell culture Protocol Step 3
Skim milk powder	Yeasen	S9129060	Immunoblotting Protocol Step 3
SKOV3-Luc	ATCC	HTB-77	Cytotoxicity assay Protocol Step 4
Trypsin-EDTA	NCM biotech	C125C1	Cell culture Protocol Step 4
Tween 20	Sinopharm	30189328	Immunoblotting Protocol Step 3
Water bath	keelrein	NB014467	Heating Protocol Step 1
X-VIVO 15	LONZA	04-418Q	Serum-free lymphocyte culture medium Protocol Step 1